Ольга Лютаревич ДНК в криминалистике гипертекстовая версия Биология уже давно заняла своё почётное место в криминалистических лабораториях, и такая непростая задача, как идентификация личности, представляется сегодня невозможной без использования методов этой науки. В настоящей статье речь пойдет о самом перспективном направлении судебно-медицинской экспертизы - идентификации личности на основе анализа ДНК. Внедрение биологических методов анализа в процесс судебной экспертизы имеет давнюю историю. Сначала на помощь дактилоскопии, имеющейся в арсенале у криминалистов с 1892 г., пришло серологическое типирование молекул, находящихся в биологических жидкостях, таких как маркеры групп крови АВ0, а также некоторых ферментов. Настоящий же эволюционный скачок в этой области произошел с началом применения ДНК-идентификации. Учитывая общеизвестный факт генетической исключительности каждого человека (кроме однояйцевых близнецов), существует распространенное мнение о 100-процентной точности идентификации личности на основании анализа ДНК. Казалось бы, все просто: достаточно сравнить ДНК подозреваемого с ДНК, полученной из биологических образцов, найденных на месте преступления и заведомо принадлежащих преступнику.   Далее остается лишь определить, соответствуют ли эти образцы друг другу, и в случае положительного ответа без сомнений вынести абсолютно справедливый обвинительный приговор (равно как и снять обвинение с человека при несовпадении результатов). Однако эта кажущаяся простота обманчива. В научных и научно-популярных изданиях можно встретить интересные данные, полученные при сопоставлении не так давно расшифрованного генома человека с геномами братьев наших меньших: например, только около 0.5-1% "букв" генома отличает нас от шимпанзе. Человек же отличается от другого (неродственного) человека лишь одним нуклеотидом из 300 - 400! То есть все мы генетически одинаковы на 99,99%.   Как же выявить столь незначительные различия? Первым человеком, который догадался, каким образом можно идентифицировать личность с использованием методов молекулярной генетики, был английский профессор Алек Джеффрис (Alec Jeffreys), опубликовавший в журнале Nature свою статью "Индивидуально-специфичные "отпечатки пальцев" ДНК человека" в июле 1985 года.   Термин "отпечатки пальцев", или же "фингерпринт", был употреблен им, конечно, иносказательно, и к традиционной дактилоскопии отношения не имеет.   Описанный Джеффрисом метод основан на способности бактериальных ферментов, называемых ферментами рестрикции, рестрикционными эндонуклеазами или просто рестриктазами, распознавать строго определенные последовательности ДНК и разрезать её по областям распознавания.   Этот факт был известен давно, однако английский ученый впервые обнаружил, что длина образующихся фрагментов различается для разных людей, отсюда и принятое название данного метода - полиморфизм длины фрагментов рестрикции (RFLP, Restriction Fragment Length Polymorphism). Внедрение же открытия Джеффриса, совершившего революцию в криминалистике, в судебную практику произошло на фоне трагических событий, случившихся двумя годами ранее. 21 ноября 1983 г. 15-летняя Линда Манн (Lynda Mann) из небольшого английского городка была найдена мертвой недалеко от своего дома. Преступление не было раскрыто, хотя убийца оставил следы своей спермы на теле жертвы. И вот спустя 3 года, 1 августа 1986 г., происходит повторение кошмара в соседней деревушке - изнасилована и задушена 15-летняя Дон Эшворт (Dawn Ashworth). Серологическая идентификация семени, обнаруженного на теле второй девушки, констатировала наличие фактора фосфоглюкомутазы, а также принадлежность крови убийцы ко второй группе. Эти данные совпадали с характеристиками, определенными в случае первой убитой девушки, однако следуя лишь им, можно было привлечь к уголовной ответственности около 10% мужского населения Британии. Тем не менее, некоторые улики свидетельствовали против молодого (17-лет от роду - FV) кухонного разносчика (Richard Buckland), и он был задержан по подозрению в совершении двойного убийства. Подозреваемый вскоре признал свою вину. Однако не все сходилось в его показаниях. К счастью, один из полицейских вспомнил о той самой статье в журнале Nature, в которой Алек Джеффрис впервые описал свой метод, и полиция, связавшись с ученым, попросила его провести сравнительный анализ имеющегося у них генетического материала. Исследование (Его провели офицеры FSS Peter Gill and Dave Werrett - FV) подтвердило идентичность образцов, найденных на обоих местах преступления, но подозреваемый Richard Buckland не имел к ним никакого отношения! 21 ноября 1986 г. Richard Buckland оказался первым человеком, освобожденным со скамьи подсудимых благодаря генетическим доказательствам. Настоящий убийца - Колин Питчфорк - был арестован год спустя. Так идентификация личности на основании данных ДНК-анализа начала своё победное шествие в криминалистике, выполняя при этом две основные задачи: анализ соответствия биологических образцов, найденных на месте преступления, с образцами, полученными от подозреваемого в совершении преступления, и установление родства по характеристикам ДНК. Несомненным преимуществом метода является то, что даже ничтожно малого количества образца оказывается достаточно для проведения анализа. Кроме того, в качестве исходного материала для выделения ДНК могут быть использованы кровь, сперма, слюна, волосы, костные ткани - любые образцы, содержащие хотя бы несколько клеток. Таким образом, имеется несколько причин, по которым молекула ДНК так привлекательна для использования в судебной идентификации: 1. Уникальность индивидуальной ДНК. Каждый человек в мире генетически индивидуален (кроме, как упоминалось выше, однояйцевых близнецов, которые, по сути, являются клонами). 2. Генетическое постоянство организма. Генетическая информация, в отличие от состава белков или жиров, не изменяется в течение жизни, а также в зависимости от типа клеток, из которых была выделена ДНК. 3. Чувствительность метода. Для современных методов ДНК-анализа достаточно даже нескольких капель крови, или образца слюны, которой наклеивалась почтовая марка на конверт, или пятна спермы, по площади в 10 раз меньше булавочной головки, или ДНК, оставшейся на выкуренной сигарете. 4. Относительная стабильность молекул ДНК. В отличие от белков, являющихся нестабильными структурами, молекула ДНК обладает повышенной устойчивостью к воздействиям окружающей среды. Это свойство ДНК является для криминалистов ценным, поскольку позволяет проводить идентификацию по прошествии даже очень большого срока давности, или же если останки человека не могут быть опознаны никакими другими методами (например, в случае авиакатастроф). Совершенствование инструментов молекулярной биологии вносило коррективы в постановку метода анализа ДНК, и сегодня он практически не используется в том виде, в котором его предложил Джеффрис. В следующей части статьи мы остановимся более подробно на технической стороне современных методов типирования ДНК, без представления о которых невозможно оценить все многообразие нюансов, возникающих в процессе экспертизы. Часть 2 Зная о генетической исключительности каждого человека, криминалисты давно мечтали о возможности использования этого свойства в целях идентификации личности. Однако практическое осуществление их мечты стало возможным лишь с 1985 года. Каким же образом проистекает процесс идентификации, если два человека генетически различаются между собой в среднем всего лишь на 0,01%? Действительно, установить столь малые различия было бы довольно сложно, если бы они были распределены равномерно по всему геному.   К счастью, задача криминалистов значительно облегчается тем, что различия, о которых идет речь, локализованы в определенных регионах (локусах) хромосом. Такие локусы получили название гипервариабельных участков. Они, как правило, расположены в зонах негенной (некодирующей, или junk) ДНК, а, следовательно, не являются генами, т.е. не кодируют белки или РНК. Анализ полиморфизма длины фрагментов рестрикции (RFLP), впервые описанный Алеком Джеффрисом, создал предпосылку для идентификации личности на основании индивидуальных генетических различий. Этот метод является интегральным и выявляет изменения как в числе и расположении специфических участков для распознавания рестриктазами (т. наз. сайтов рестрикции), так и изменения (удлинение или укорочение) самих гипервариабельных участков. Появление новых или исчезновение существующих сайтов рестрикции происходит вследствие мутаций: замен отдельных нуклеотидов, а также инверсий ("перевертываний"), делеций (потерь) и инсерций (вставок) участков ДНК. Изменения же длины гипервариабельных участков обусловлено более сложными реорганизациями генома: транспозициями, неравными рекомбинациями и "проскальзыванием" ДНК-полимеразного комплекса. В результате подобных редких "сбоев" ДНК различных людей режется рестриктазами на разные неравные "куски"... Принцип метода RFLP Схематично RFLP-анализ можно представить следующим образом: после обработки ферментами рестрикции различные образцы ДНК помещают на разные дорожки в гель и подвергают воздействию электрического поля (процесс носит название гель-электрофореза). Электрическое поле заставляет их двигаться по своим дорожкам, причем более мелкие фрагменты движутся быстрее, чем крупные. Далее фрагменты переносятся на нитроцеллюлозную мембрану (процесс блоттинга), с которой они прочно связываются.   Мембрана помещается в раствор, содержащий радиоактивную ДНК-пробу, где происходит гибридизация пробы с уникальными последовательностями гипервариабельных участков. Затем мембрану накладывают на рентгеновскую пленку и получают радиоавтограф, на котором радиоактивные элементы выявляются в виде серии полос, число и положение которых различно для каждого индивида. Помимо радиоактивных, существуют также другие методы детекции, такие как флуоресцентная визуализация, хромогенные иммунохимические реакции и т.д. Однако независимо то того, какой ДНК-зонд был использован, на конечном этапе анализа формируется графический образ: дорожка, поперечно исчерченная чередующимися полосами. Что же представляют собой гипервариабельные участки ДНК? Как показали исследования Джеффриса, одними из таких регионов являются структуры, известные как VNTR (Variable Number of Tandem Repeats, вариабельное число тандемных повторов) и широко использующихся для целей идентификации по настоящее время. В каждый VNTR-локус входит от 500 до 10 000 пар нуклеотидов. Особенность VNTR заключается в том, что они целиком состоят из одной-двух ключевых последовательностей нуклеотидов, длиной обычно в 15 - 35 пар оснований, которые непрерывно повторяются большое количество раз (поэтому вся последовательность VNTR и называется тандемной). Именно к таким тандемным последовательностям VNTR и подбирают зонды при детекции по методу RFLP. Число повторов в данном конкретном VNTR различно для разных людей. В человеческой популяции насчитывают до ста и более известных разновидностей (аллелей) по длине для каждого VNTR. При этом ни одна из них не является особенно распространенной, поэтому возможно огромное число вариаций длин разных VNTR между индивидами, проявляющихся при проведении RFLP. Данная конкретная последовательность VNTR может быть либо уникальной в геноме (т.е. находиться только в одном локусе), либо "разбросанной" по нескольким участкам ДНК. Соответственно, анализ с использованием зонда к уникальной последовательности (монолокусный анализ) даст в результате одну или две полосы на "ДНК-дорожке". Одна полоса образуется в том случае, если отец и мать исследуемого индивида обладали одной и той же разновидностью данного гипервариабельного участка VNTR. Полилокусный (мультилокусный) же анализ даст более сложную картину из множества чередующихся полос. Использование анализа VNTR очень удобно и для целей установления отцовства. Для вынесения вердикта рассматриваются те локусы, по которым ребенок является гетерозиготным, то есть когда варианты VNTR, полученные им от отца и от матери, различны. В этом случае положение каждой из дорожек должно совпадать с дорожкой того из родителей, от которого был унаследован соответствующий VNTR. И все же в некоторых случаях использование VNTR оказывается невозможным. Такие ситуации возникают, например, если имеется недостаточное количество образца для проведения анализа. К тому же, большое число повторов в VNTR, способствующее их большей вариабельности, в некоторых случаях может оказаться их недостатком: чем длиннее фрагмент ДНК, тем больше вероятность того, что он подвергнется деградирующему воздействию различных повреждающих внешних факторов. Так, анализ VNTR часто оказывается неприемлемым для идентификации останков по прошествии длительного отрезка времени, а также сильно поврежденных останков (в результате катастроф и т.д.).   Поэтому в таких случаях принято исследовать фрагменты другого типа - STR (Short Tandem Repeats, короткие тандемные повторы). Как и VNTR, STR состоят из тандемных повторов длиной в несколько нуклеотидов (обычно от 3 до 5 пар оснований), только число таких повторов меньше, и, следовательно, имеется меньше разновидностей каждого локуса (от 7 до 15 на локус). Но именно благодаря небольшим размерам удобно их исследование посредством полимеразной цепной реакции (ПЦР). Часть 3 Полимеразная цепная реакция (ПЦР) представляет собой процесс контролируемого "молекулярного копирования" ДНК, позволяющий нарабатывать (амплифицировать) сколь угодно большое число интересующих последовательностей ДНК. Процесс амплификации напоминает процесс воспроизведения ДНК, который происходит в клетке перед её делением, с тем лишь отличием, что копируется не вся хромосома, а лишь маленький её фрагмент. Открытие ПЦР (1983-1984 гг, Кэри Б. Мюллис (Kary B. Mullis), Нобелевский лауреат по химии 1993 г.) произвело революцию в молекулярной биологии, и трудно перечислить все разнообразие отраслей фундаментальной науки и практической медицины, в которых используется этот метод в настоящее время. Благодаря ПЦР имеется возможность работать с единичными молекулами ДНК, увеличивая их количество в миллионы раз. ПЦР-анализ - это многоступенчатый процесс. На первом этапе проводится температурная денатурация ДНК, в результате которой двухнитевые сегменты разделяются на отдельные цепи. Затем происходит гибридизация однонитевых фрагментов с праймерами - короткими (20-25 нуклеотидов) сегментами ДНК.   Гибридизация праймеров осуществляется с комплементарными им участками ДНК, располагающимися по флангам интересующей двухнитевой последовательности. Далее происходит достройка "дочерней" полинуклеотидной цепи на ДНК-матрице в пределах, ограниченных праймерами, с помощью фермента ДНК-полимеразы.   Каждый из этапов реакции требует оптимального для него температурного режима, и конечно, подбор праймеров для ПЦР осуществляется таким образом, чтобы они связывались именно с теми последовательностями, которые ограничивают анализируемые гипервариабельные локусы (т.е. эти последовательности должны быть заведомо известны). Принцип ПЦР Амплифицированные STR-фрагменты, аналогично VNTR-фрагментам, фракционируют в геле и визуализируют их, используя различные методы детекции. В последнее время для этих целей принято использовать флуоресцентные метки, возбуждаемые лазерным излучением, поскольку такой метод, хотя он и требует специального оборудования и значительных материальных затрат, является наиболее чувствительным и позволяет проводить исследование в режиме реального времени. Более того, благодаря разноцветным флуоресцентным меткам, имеется возможность анализировать несколько локусов одновременно. Несомненно, методы на основе ПЦР имеют ряд преимуществ по сравнению с VNTR-анализом. Во-первых, они позволяют проводить непосредственное измерение длины каждого гипервариабельного STR-локуса. Это дает возможность избежать проблем неопределенности, связанной с действием рестриктаз, при интерпретации результатов. Во-вторых, получить результаты ПЦР-анализа удается обычно в течение 24 часов, что значительно сокращает время исследования. И наконец, ПЦР очень удобна в тех случаях, когда имеется ничтожно малое количество образца. И все же, нет ничего совершенного, поэтому не стоит забывать об опасности ложного типирования. Чувствительность ПЦР - это также и слабая её сторона. В случае образца, загрязненного посторонней ДНК, может быть произведено множество её копий: процесс амплификации настолько эффективен, что даже нескольких случайных молекул ДНК, попавших в образец, бывает достаточно для того, чтобы прийти к ложным выводам.   Артефакты возможны также как результат неправильного подбора условий ПЦР, при амплификации неспецифических (неаллельных) фрагментов и в некоторых других случаях. Ещё одним недостатком определения STR-фрагментов является то, что они, как правило, имеют меньше аллелей, чем VNTR, и распределение частот аллелей в популяции не такое равномерное. Вследствие этого лаборатория, использующая STR анализ, вынуждена исследовать больше локусов для получения того же количества информации относительно подобия генетического профиля двух людей. Теоретически, самым точным и информативным методом анализа индивидуальных генетических различий является секвенирование ДНК - "побуквенное" прочтение цепи ДНК. Однако секвенирование всего генома требует слишком высоких затрат времени и материальных средств. Альтернативой ему служит секвенирование полиморфных локусов митохондриальной ДНК. Митохондриальная ДНК локализована не в ядре, а в митохондриях - клеточных органеллах, которые содержат свои собственные маленькие геномы, - циклические молекулы ДНК из 16 569 пар оснований. Ряд уникальных биологических свойств делают митохондриальную ДНК высокоинформативным, а в некоторых случаях и единственно применимым инструментом судебно-медицинской экспертизы: она обладает быстрым темпом мутирования (следовательно, высокой изменчивостью), большим числом копий в каждой клетке, материнским характером наследования (то есть каждая молекула передается человеку в неизмененном виде от матери). Исследование митохондриальной ДНК осуществлялось, например, при установлении принадлежности знаменитых Екатеринбургских останков к семье Романовых. Однако все описанное выше, то есть молекулярно-генетический анализ ДНК - лишь один из этапов идентификации, и для вынесения окончательного результата необходим статистический анализ полученных данных, особенно важный при совпадении генотипов преступника и подозреваемого: ведь в этом случае речь идет порой о человеческой жизни. Независимо от того, какой тип ДНК-тестирования был использован, интерпретация результатов [Интерпретация - самая главная проблема любой науки - FV] призвана ответить на два вопроса.   Во-первых, необходимо определить, соответствует ли профиль ДНК, взятый на месте преступления, образцам, полученным от подозреваемого. Во-вторых, в случае соответствия, необходимо определить его достоверность. Другими словами, нужно выяснить, насколько распространен данный ДНК-"отпечаток" в популяции, то есть насколько вероятна уникальность полученного ДНК-фингерпринта. Вероятность точности идентификации - это и есть та самая цифра, которая представляется в суде. Её величина, удовлетворяющая суд, зависит от обстоятельств дела, и обычно она тем выше, чем более суровое наказание грозит обвиняемому. В США, например, существует требование, чтобы обнаруженный ДНК-фингерпринт был уникален в популяции, численность которой на порядок превышает население Земли. Для вынесения обвинения нужно убедиться в том, что фрагменты, полученные от подозреваемого и с места преступления, мигрируют в геле на одинаковое расстояние. Последующая компьютерная обработка данных должна подтвердить, что различия в уровне миграции статистически недостоверны (это - этап определения соответствия). Далее следует оценка достоверности соответствия, основанная на принципах популяционной генетики. Очевидное соответствие ДНК подозреваемого и ДНК, полученной на месте преступления, ещё не позволяет предъявить ему обвинение: ведь это совпадение может быть случайным, и аналогичный ДНК-профиль может быть присущ другому человеку.   С какой вероятностью возможно такое совпадение? Для ответа на этот вопрос исследователь должен знать относительную частоту, с которой исследуемые варианты (аллели) гипервариабельных участков присутствуют в определенной популяции (к которой относится подозреваемый). Однако это не всегда возможно, поэтому во многих случаях приходится опираться на косвенные данные. Общеизвестно, что формирование популяции не случайно, и люди склонны выбирать себе партнера из той же географической области [А охота к перемене мест? - FV], этнической группы [А смешанные браки? - FV] или имеющего такие же религиозные взгляды [Почему только религиозные? - FV], а также в зависимости от его физических и поведенческих особенностей [А менталитет? А установки? А стереотипы? - FV].   Всё это накладывает свой отпечаток на частоту возникновения аллелей в популяции. Учёт этих данных требует сложного статистического анализа [Как будто существует "простой анализ" - FV], и в мире до сих пор ведутся дебаты о том, какой из методов наиболее полно учитывает все разнообразие популяционно-генетических данных. В случае отсутствия генетических данных о популяции, к которой относится подозреваемый, используются данные по другим популяциям, которые обрабатываются с помощью специальных коэффициентов пересчёта, что, конечно, снижает надежность идентификации. Кроме того, итоговая вероятность зависит от множества других обстоятельств: вовлечение нескольких подозреваемых или содержание в образцах смеси биологического материала от разных лиц, что значительно усложняет статистический анализ и интерпретацию результатов теста. Система CODIS В мире существует несколько систем с установленным стандартным набором локусов, по которым проводится ДНК-идентификация. В США, например, принята система CODIS, в которую входит 14 STR-локусов. Они находятся на разных хромосомах, и их независимое распределение делает статистический анализ более достоверным. В Европейских странах более распространен набор ENFSI, по которому исследуется 9 локусов. В России часто используют набор фирмы Promega. Также существуют другие локусы, анализ которых проводится по мере необходимости. Что касается лабораторных ошибок, возможность которых никогда нельзя исключать при проведении анализа, то именно они являются причиной нарастающего скепсиса общественности в отношении ДНК-идентификации. Ошибки могут возникать на каждом из этапов экспертизы - от сбора образцов до вынесения итогового заключения. Совсем несложно перенести ДНК с одного места на другое, смешать пробы и т. д., то есть сфальсифицировать результаты судебного исследования.   Причем допущенные ошибки [А разве существуют ошибки "недопущенные"? - FV] могут быть обращены как во вред, так и в пользу подозреваемого. [Высказывание автора о Пользе и Вреде показывает, что установление истины до сих пор не является задачей российских судов - FV]   Так, со скамьи подсудимых был освобожден футболист О. Дж. Симпсон, обвинявшийся в убийстве своей бывшей жены и её бой-френда. Несмотря на то, что результаты ДНК-анализа указывали на его виновность, грамотно проведенная защита, выявившая ошибки, допущенные в ходе следствия и экспертизы, не позволила суду вынести обвинительный приговор.   [Такие судебные решения называются не приговоры, а вердикты. Их никуда и никогда не "выносят", т.к. некуда и незачем... Их оглашают принародно. И делает это не судья, а специально для каждого конкретного дела созданное Жюри из представителей народа. Процедура - ужастно простая. Судья формулирует вопрос или вопросы и задаёт их упомянутому Жюри. После окончания судебного расследования дела, которое производится гласно в судебном заседании, Жюри удаляется в совещательную комнату, где на основе исключительного единогласия (принцип Liberum veto) формулирует на вопросы судьи короткие ответы типа "да\нет", т.е. по первому пунту - виновен, по второму - нет, и т.д. и т.п. Классический фильм на эту тему "12 разгневанных мужчин" - FV] И все же результаты применения молекулярно-генетических методов в криминалистике очевидны: во всем мире начинают выпускать на свободу людей, проведших долгие годы в заключении вследствие несправедливого обвинения. Анализ давних дел, по которым подозреваемые в совершении преступления были признаны виновными, проводится регулярно [т.е. один раз в 100 лет или один раз в минуту? - FV], однако лишь четверть пересмотренных с использованием новых технологий дел заканчивается освобождением осужденного. Но ведь это тоже положительный результат, не так ли? И ДНК-идентификация должна была появиться хотя бы ради этих людей, вновь обретших свободу, которой их незаслуженно лишили. [А Глеб Жеглов считал, что незаслуженно осужденных не бывает - FV] Источник Крим   www.pseudology.org