М., Медицина, 1998 Игорь Валерьянович Домарадский К 100-летию противочумной службы России 3. Возбудитель чумы 3.1. Общая характеристика Возбудитель Чумы (Yersinia pestis (Leman и Neumann, 1896; van Logem, 1944) (является типовым видом рода Yersinia, относящимся к семейству Enterobacteriaceae. Помимо чумного микроба, к этому роду относятся еще 6 видов бактерий: Y. pseudotuberculosis, Y. enterocolitica, Y. intermedia, Y. ruckeri, Y. frederiksenii и Y. kristensenii. По культурально-биохимическим и некоторым другим свойствам ближе всего к чумному микробу стоят первые два вида, из которых Y. pseudotuberculosis называют даже его двойником. Однако по эпидемиологическим особенностях и патогенезу вызываемых инфекции Y. pseudotuberculosis и Y. enterocolitica существенно оличаются от Y. pestis Ниже приводится общая характеристика Y. pestis, основанная на работах В. М. Туманского [1958], R. Pollitzer [1954] и G. S. Wilson и A. A. Miles [1964], а также на собственных данных [Домарадский И. B, 1971; Домарадский И. В. и др., 1974]. По морфологии (Y. pestis относительно мелкая, прямая, с закругленными концами палочка длиной 1-3 мкм и шириной 0,3-0,7 мкм. Отличается большим полиморфизмом, особенно в мазках из содержимого бубонов и 3 %-солевого агара. Спор не образует. В организме животных и людей и на сывороточном или кровяном агаре при температуре 37 (С обычно образует капсулу. Легко воспринимет анилиновые красители. Окрашивается биполярно. Грамотрицательна. Кислотоустойчивостью не обладает. Неподвижна (без жгутиков) (рис.6,7). На пластинках агара сначала образует прозрачные "кружевые платочки", что имеет диагностическое значение, а затем вырастает в виде блестящих, серовато-белых, прозрачных колоний с выпуклыми мелкозернистыми центрами и плоскими, волнистыми ("фестончатыми") краями (R-форма) (рис.8). При температуре 26-28 (С колонии суховаты, а колонии же, полученные при температуре 37 (С имеют маслянистую консистенцию, вследствие чего клетки легче суспендируются, иногда тянутся за петлей. По мере старения центр их становится более грубым, менее прозрачным и приобретает коричневатый оттенок. На кровяном агаре через 48 ч. при температуре 37 (С образует подобные же колонии, но менее дифференцированные; иногда вызывает (-гемолиз, а также легкое просветление среды или делает её более тёмной. На скошенном агаре микроб растёт в виде сероватого, вязкого, влажного, нежного, прозрачного налёта. На дезоксихолатно-цитратном агаре при температуре 37 (С через 48 ч. вырастает в виде немногочисленных красноватых колоний величиной с булавочную головку. На агаре МакКонки через 24 ч. при той же температуре даёт слабый сливной рост, едва различаемый невооруженным глазом. Столбик среды Тимофеевой-Головачёвой окрашивает в красновато-оранжевый цвет, скошенную поверхность не изменяет. На пластинках желатины формирует плоские серые колонии с зернистыми центрами. В столбике желатины растёт по поверхности и в глубине, среду не разжижает. На свернутой сыворотке по Лёффлеру через 24 ч. при температуре 37 (С даёт довольно хороший сливной рост, разжижения не вызывает. Молоко с лакмусом не свертывает, цвет его не изменяет или вызывает легко покраснение. На картофеле развивается слабо. В бульоне обычно образует хлопьевидный или порошковидный, легко распадающийся при встряхивании осадок , жидкость над ним остается прозрачной. Часто образует нежную пленку; в старых культурах от неё вглубь среды могут отходить нити ? "сталактиты" (рис.9). В связи с относительной неприхотливостью Y. pestis растёт на синтетических средах с аминокислотами (в качестве источников азота) и ферментируемыми углеводами. В витаминах и азотистых основаниях, как правило, не нуждается. Однако аминокислотные потребности у штаммов из разных природных очагов сильно варьируют. Кроме того, они могут меняться в зависимости от температуры культивирования. В связи с этим следует подчеркнуть неоднородности популяций чумного микроба по аминокислотным потребностям, которая безусловно имеет определенную биологическую целесообразность. Весьма вероятно, что при неблагоприятных условиях внешней среды возбудитель Чумы может выживать не только за счёт появления прототрофных мутантов, но и благодаря синтрофизму между ауксотрофными мутантами, отличающимися по потребности в аминокислотах [Лебедева С. А. и др., 1970]. Факультативный анаэ роб. Для роста из небольших посевных доз на плотных средах нуждается в понижении окислительно-восстановительного потенциала, достигаемом, в частности, за счёт добавления сульфита натрия, крови или гемина. На жидких средах хорошо развивается при аэрации. Оптимум температуры роста ? 26-28 (С, пределы ? от (2 до + 45 (С. Оптимум pH (7,0--7,2, пределы (5,0-9,5. Чаще образует бактериоцин (пестицин I), свертывает плазму крови и вызывает фибринолиз. Мочевину обычно не разлагает (см. стр. 55). Индол и ацетилметилкарбинол не образует. Продукция сероводорода бывает на жидких средах с ферментируемыми сахарами. Дает положительную реакцию на аммиак и обычно с метиловым красным. Метиленовую синь редуцирует редко. Нитраты чаще востанавливаает до нитритов. Каталазу и оксидазу образует. Декарбоксилирует аргинин и нерегулярно гистидин. Углеводы и их производные ферментирует до кислоты без газа (табл. 11). Содержание Г+Ц в ДНК равно 46 % (по температуре плавления). В чистых культурах Y. pestis высокочувствительна к обычным дезинфектантам. Отличается небольшой устойчивостью в окружающей среде; чувствительна к высушиванию, особенно при резких колебаниях влажности; быстро погибает под действием солнечных лучей. В мокроте и крови остается жизнеспособной значительно дольше. Низкую температуру переносит хорошо, в замерзших трупах сохраняется несколько месяцев. Чумной микроб чувствителен ко многим сульфаниламидным препаратам и антибиотикам, но резистентен к пенициллину (образует пенициллиназу). Закончив общую характеристику тинкториальных и культурально-биохимических свойств Y. pestis, остановимся на некоторых наиболее важных, с нашей точки зрения, аспектах ее биологии. 3.2. Морфологические особенности Клетка Y. pestis построена по типу, присущему клеткам всех грамнегативных бактерий, но отличается рядом особенностей [Кац, Л. Н., 1966; Голубиниский Е. П. и др., 1971; Наумов А. В., Самойлова Л. В., 1992]. Скелет клетки, представленный трехслойной мембраной, придает клетке овоидную форму со вздутьями по бокам и закруглениями на концах. Средний слой отличается способностью интенсивно абсорбировать красители на полюсах клетки (столь типичная для чумного микроба биполярная окраска обусловливается именно этим). Структурную основу внешней мембраны клеточной стенки составляет липополисахаридно-белковый комплекс, однако у чумного микроба липополисахарид (ЛПС) подобен ЛПС R-мутантов грамотрицательных бактерий, чем, в частности, объясняются характерные особенности роста Y. pestis на искусственных питательных средах [Бахрах Е. Э.,1973; Тараненко Т. М., 1988]. На поверхности клеточной стенки при надлежащих условиях культивирования микроба выявляются пилеобразные или фимбриоподобные структуры, имеющие белковую природу [Водопьянов С. О. и др., 1985; Linder L. E. et al., 1990] После выращивания при температуре 37 (С и в мазках из органов животных клетки окружены гликопротеидной капсулой. 3.3. Метаболизм По типу метаболизма все иерсинии, включая чумной микроб, характеризуются как типичные представители семейства кишечных бактерий. Прежние наши возражения против подобного заключения были основаны на иных подходах к таксономии бактерий. Нам казалось, что при классификации микробов нужно исходить из экологического принципа, который учитывает все особенности, а не ограничиваться анатомо-физиологическими данными о бактериях [Домарадский И. В., 1971]. Впрочем, мы и теперь так считаем и если все же мы говорим, что Yersinia являются типичными представителями семейства Enterobacteriaceaе, то, во-первых, следуем устоявшейся традиции, а, во-вторых, хотим подчеркнуть присущую всем членам этого семейства специфику обмена веществ (и только!). Вместе с тем, мы снова подчеркиваем, что по крайней мере Y. pestis, по характеру обитания в природе, а также патогенезу и механизму передачи вызываемой в естественных условиях инфекции на "кишечные" бактерии никак не похож. Большое значение для физиологии чумного микроба имеет гликолиз ? универсальный и в тоже время филогенетически наиболее древний путь метаболизма углеводов. Об этом свидетельствуют, как данные табл. 11, так и сведения о конечных продуктах диссимиляции углеводов (табл. 12) и наличии у него соответствующих ферментов. Катаболизм других углеводов и близких к ним соединений обычно начинается с превращения в субстраты, доступные для сбраживания. Примечательно, что Y. pestis присуща способность не только к анаэробному, но и к аэробному гликолизу, энергетически более выгодному, чем первый. Не есть ли все это следствие "солидного" возраста возбудителя Чумы, ставшего им еще задолго до появления человека, в мезозое, т. е на заре царства млекопитающих ? единственных хозяев микроба? Что касается окисления моносахаридов до двуокиси углерода с промежуточным образованием пентозо- и гептозофосфтов (гексозомонофосфатный путь или пентозный цикл), то его удельный вес в метаболизме чумного микроба весьма невелик, хотя, по-видимому и достаточен для обеспечения его пентозами для образования нуклеиновых кислот [Рублев Б. Д., Голубинский Е. П., 1971]. Низкую активность этого цикла связывают с отсутствием у чумного микроба глюкозо-6-фосфат дегидрогеназы, отличающее его от возбудителя псевдотуберкулёза [Mortlock R., Brubaker R., 1962]. Помимо гликолиза, источником энергии для чумного микроба является окисление глюконата по схеме Энтнера-Дудорова, что установлено R. Mortlock [1962] и подтверждено мною и моими коллегами [Рублев Б. Д. и др., 1971]. Однако как и для других аэробных микоорганизмов, основным источником энергии для чумного микроба служит цикл Кребса. При этом обращает на себя внимание то, что ему присущ даже глиоксилатный цикл, который используется в качестве источника метаболитов для синтеза углеродных скелетов углеводов, причём для этого он обладает несколькими формами изоцитрат-лиазы [Hiller S., Charnetzky W., 1981]. В связи с углеводным обменом нужно заострить внимание читателей еще на двух вопросах, которые тесно связаны с таксономией. Прежде всего мы имеем в виду отношение Y. pestis к глицеролу. Как известно уже давно [Безсонова, 1928], по этому признаку различают две группы штаммов ? глицериннегативные и глицеринпозитивные. В подавляющем большинстве случаев первые выделяются в тех очагах, где хранителями чумного микроба являются крысы ("океанические" штаммы). Чаще всего оканические штаммы встречаются в очагах тропического пояса. Вторые же обычно выделяются от сусликов, сурков и песчанок. В связи с этим распространение глицеринпозитивных штаммов географически привязано к ареалам распространения указанных видов грызунов ("континентальные" штаммы). По нашим данным [Домарадский И. В. и др., 1974], причина негативного отношения чумного микроба к глицерину может заключаться в утрате им только одного фермента ? первого в цепи последующих, а именно глицеролдегидрогеназы. Однако чем объяснить подобную "диссоциацию" чумного микроба ? особенностями обмена веществ его хозяев или какими-то другими факторами (абиотическими?), пока никто не знает. Второй вопрос касается рамнозы. После того как А. А. Безсонова [1929] предложила среду с рамнозой для дифференциации Y. pestis от Y. pseudotuberculosis, отношение чумного микроба к этой пентозе стало предметом многочисленных исследований. При этом выяснилось, что неспособность ферментировать рамнозу является весьма постоянным признаком чумного микроба. Однако, как показала E. Englesberg [1957а], начиная с 6-го дня инкубации могут появляться рамнозопозитивные клоны, с частотой порядка 10-11, с чем и связана "поздняя" ферментация, которую подчас наблюдают в лабораториях. Продолжив изучение отношения к рамнозе, E. Englesberg [1957б] показала, что рамнозопозитивные мутанты чумного микроба окисляют эту пентозу только в том случае, если их предварительно выращивают в её присутствии. При выращивании же на среде с глюкозой окисление рамнозы начинается лишь после 50-минутного контакта с ней и максимальное потребление кислорода достигается к концу 2-го часа. Однако при этом рамноза окисляется неполностью, причём одним из продуктов распада является 2-оксипропионовый альдегид. У "адаптированных" рамнозопозитивных мутантов были обнаружены изомераза рамнозы, катализирующая её превращение в рамнулозу, и рамнулозокиназа. Однако, помимо разложения рамнозы в поздние сроки, причина которого установлена E. Englesberg [1957а], встречаются случаи, когда оно регистрируется одновременно с ферментацией других углеводов; обычно с этим сталкиваются при работе со штаммами, выделенными в горных очагах. Чем объяснить эту особенность "горных" штаммов, сказать мы не можем. Реакции переаминирования являются центральными реакциями в белковом обмене животных, растений и микроорганизмов. Поэтому неудивительно, что они выявлены и у чумного микроба [Оленичева Л. С., Атарова Г. Т., 1967]. Обращает на себя внимание то, что в отличие от Y. pseudotuberculosis, чумной микроб лишен (-глутаматтрансферазы, (факт, представляющий интерес для их дифференциации [Bercovier H. et al., 1981]. Помимо трансаминаз, у Y. pestis обнаружены дезаминазы ряда аминокислот [Домарадский И. В., 1956] и декарбоксилаза аргинина. Наличие последней также важно для диагностики [Шиманюк Н. Я., 1972]. Показана способность чумного микроба превращать одни амнокислоты в другие, в частности орнитин в аргинин, аспартат в пролин, цистеин в метионин [Сучков Ю. Г. и др., 1971; Король В. В., 1973]. Все сказанное, вместе с независимостью от азотистых оснований и дополнительных факторов роста9, объясняет относительную неприхотливость чумного микроба к питательным средам. Однако её степень во многом зависит от происхождения штаммов, что было подмечено нами [Домарадский И. В., 1956] и стало общепризнанным в результате работ И. Л. Мартиневского [1969]. В качестве примера связи потребности в аминокислотах с происхождением штаммов можно сослаться на данные, приведенные в табл. 13. Из других азотистых соединений внимания заслуживает мочевина, отношение к которой давно уже помогает отличать чумной микроб от возбудителя псевдотуберкулеза. Правда, сомнения в надежности этого теста были посеяны Г. Н. Ленской [1944] и Е. Е. Пунским [1960], что было связано с несовершенством тогдашней методики определения уреазы, однако после специальных исследований нескольких сонен штаммов разного происхождения неспособность чумного микроба гидролизовать мочевину была признана непреложной истиной. 3.4. Вопросы таксономии Как видно из приведенных выше фактов, по некоторым признакам одни штаммы чумного микроба отличаются от других, что с легкой руки R. Devignat [цит. по Pollitzer R., 1954] и В. М. Туманского [1958] послужило основанием для постулата о внутривидовой неоднородности чумного микроба. Исходя из этого постулата, одна за другой стали появляться схемы соответствующих классификаций, например Л. Н. Классовского и В. С. Петрова [1970], Л. А. Пейсахиса и В. М. Степанова, [1975], Л. А. Тимофеевой и А. И. Логачёва [1975], построенные в общем по одному принципу ? на признании зависимости особенностей штаммов от видовой принадлежности носителя возбудителя Чумы ("зоологическая" классификация). Это привело к тому, что в 1985 г. на Всесоюзном совещании по таксономии чумного микроба была принята единая "систематическая схема подвидовых категорий для возбудителя Чумы, о чём было сделано уведомление в Национальный центр по таксономии бактерий" [Наумов А. В., Самойлова Л. В., 1992]. "Универсальная" схема для определения подвидов чумного микроба, основанная на результатах определения коэффициентов подобия (S) между различными штаммами, отражена в табл. 13. Эта схема полнее, нежели другие, и удобнее для практики. Наше отношение к подобным классификациям сформировалось более 25 лет назад и с тех пор не изменилось [Домарадский И. В., 1971]. Мы по-прежнему считаем, что известные теперь различия между штаммами не могут служить достаточно веским аргументом в пользу существования подвидов чумного микроба. Мы не понимаем, почему не признать наличие вариаций ("биоваров" или "биотипов"), как это сделано, например, в случае Y. enterocolitica? Следует также подчеркнуть, что все известные нам схемы внутривидовой классификации штаммов чумного микроба построены на результатах изучения штаммов из природных очагов СНГ и поэтому являются узкими, "национальными". К их составлению совершенно не привлекаются данные о штаммах из зарубежных природных очагов. Мы не исключаем, что, если следовать логике отечественных исследователей, то в таком случае число "подвидов" увеличилось бы в несколько раз! И еще одно замечание. Делению на подвиды придают у нас такое большое значение, поскольку оно якобы позволяет внести больше ясности в проблему изучения природных очагов Чумы и наметить "правильные пути "для их ликвидации [Туманский В. М., 1958]. Но ведь независимо от вида носителя и географической зоны выделения возбудителя Чумы к ликвидации её очагов нужно стремиться всегда (мы имеем в виду не природный очаг, а очаг непосредствнного заражения людей). При этом важно не то, ферментирует ли микроб глицерин и восстанавливает нитраты, а в какой мере он способен вызывать Чуму. Насколько нам известно, эпидемии Чумы вызывали все (кроме полёвочьей?) "разновидности" чумного микроба, но отличия между ними определялись отнюдь не подобными признаками штаммов. Добавим, что в одних и тех же природных очагах могут циркулировать разные штаммы, а при пассажах через организм соответствующих видов грызунов одна "разновидность" может превращаться в другую. Наконец, отметим, что многие систематики животных давно уже избегают пользоваться понятием "разновидность" [ Ралль Ю. М., 1965; Завадский К. М., 1968]. Пора это сделать и микробиологам! Как полную противоположность только что сказанному и противоречащую здравому смыслу, надо расценивать попытку H. Berсovier и соавт. [1980] объединить два вида (Y. pestis и Y. pseudotuberculosis (в один (Y. pseudotuberculosis, и подразделить его на два подвида: Y. pseudotuberculosis subsp. pseudotuberculosis и Y. pseudotuberculosis subsp. pestis. К счастью, эта попытка большинством учёных была отвергнута. Поскольку речь идёт о таксономии, нельзя обойти молчанием навязший на зубах вопрос о переходе одного вида микроба в другой. Мы имеем в виду высказывание А. И. Дятлова [1989] о "…возникновении чумного микроба из родственных ему сапрофитических форм в наше время, перед каждым случаем активизации очаговости Чумы на каком-либо из участков очага после многолетних периодов отсутствия там эпизоотий". Как видно, А. И. Дятлов пошёл дальше авторов теории превращения чумного микроба в псевдотуберкулёзный [Ленская Г. Н., 1951; Жуков-Вережников Н. Н., 1957] и наоборот, псевдотуберкулёзного в чумной микроб. [Blanc G. , Mollaret H., 1962]! 3.5. Генетика 3.5.1. Конъюгация Поиски половой дифференциации у возбудителя Чумы начались вскоре после выхода в свет книги Ф. Жакоба и Э. Вольмана [1962]. Однако очень быстро стало ясно, что собственного полового фактора типа F-плазмиды кишечной палочки ни у чумного микроба, ни у других иерсиний нет. Соответствующие данные можно найти в литературе [Домарадский И. В. и др., 1974]. Поэтому внимание исследователей быстро переключилось на изучение возможности придания иерсиниям способности к конъюгации за счёт чужеродных плазмид, обладающих Tra опероном. Тут первыми успеха добились S. Martin и F. Jacob [1962], которые сумели передать чумному микробу плазмиду F(lac Escherichia coli, получив Lac+ клоны. Позднее О. А. Проценко и П. И. Анисимов [1968, 1969] дополнили характеристику фенотипического выражения этой плазмиды в чумном микробе данными об образовании его рекомбинантами специфических пилей и об участии в гидролизе лактозы индуцибельной (как у E. coli) (-галактозидазы. Аналогичные результаты были получены на возбудителе псевдотуберкулёза. После этого начались попытки использования F(lac и F(cml штаммов обоих микроорганизмов для картирования их хромосом [Проценко О. А., 1970; Lawton W. D. et al., 1968]. Однако по ряду причин результаты не оправдали надежд и, насколько нам известно, к этому больше не возвращались, о чём можно только сожалеть. Дело в том, что в свое время в Ростовском противочумном институте был апробирован другой подход к решению указанной проблемы, основанный на принципе "специфического" мутагенеза, т. е. на получении желаемых мутантов при действии на синхронизирванные клетки специально подобранных агентов. В результате исследований удалось определить последовательность расположения на хромосоме штамма EV ряда локусов [Домарадский И. В. и др., 1974]. Впрочем у авторов не было уверенности в том, что в их опытах всегда имели место прямые, а не супрессорные мутации, и как раз в этом-то могла бы помочь разобраться конъюгация, опосредованная F-плазмидами. Весьма примечательно, что одним из последствий приобретения чумным микробом F(-плазмид была обратимая утрата им вирулентности [Zsigray R. et al, 1983, 1985]. Вторым типом гетерологичных конъюгативных плазмид, которые переносились в клетки иерсиний и придавали им свойства доноров генетической информации, оказались R-факторы кишечной палочки [Ginosa R. S., MatneyT. S., 1963; Knapp W., Lebek G. , 1967]. Однако частоты передачи различных R-факторов и экспрессии в чумном микробе соответствующих генов резистентности колебались в значительных пределах [подробнее см. ? Домарадский И. В. и др.,1974]. Важно подчеркнуть, что собственных плазмид множественной лекарственной резистентности у чумного микроба нет. Одна из причин этого может заключаться в том, что Чума относится к числу кровяных инфекций с трансмиссивным механизмом передачи. Именно эти два обстоятельства позволяют чумному микробу избежать контакта с основным резервуаром R-плазмид в природе (кишечными бактериями. В какой-то мере подобное объяснение подтверждается находками R-плазмид у Y. pseudotuberculosis и Y. enterocolitica [Дроздов А. В. и др., 1992; Bechtel J., Boring J. R., 1979], заражение которыми происходит per os. Впрочем это можно объяснить и другой причиной (наличием у иерсиний мощной Системы рестрикции/модификации, препятствующей проникновению в клетки чужеродной генетической информации и обусловливающей быструю её элиминацию [Cornelis G., Colson C. 1975]. Весьма вероятно, что поэтому даже у псевдотуберкулёзного микроба и возбудителя кишечных иерсиниозов R-плазмиды встречаются очень редко. Так или иначе, но открытие возможности передачи чумному микробу R-плазмид сыграло большую роль в изучении его генетики и имеет практическое значение. В частности, R-плазмиды были использованы для конструирования одного из вариантов вакцинного штамма (см. ниже), получения полирезистентнных вирулентных штаммов для испытания эффективности различных схем лечения Чумы и для передачи чумному микробу от Y. pseudotuberculosis генов, ответственных за ферментацию раффинозы [Домарадский и др., а. с. СССР, № 3107970 от 14.04.81]. 3.5.2. Трансформация На основании результатов многих исследований было сделано однозначное заключение об отсутствии у чумного микроба естественной компетентности для восприятия как гомо-, так и гетерологичной ДНК. В то же время удалось показать, что у клеток чумного микроба (и других иерсиний) её можно искусственно вызывать, но только для плазмидных и фаговых ДНК. Эффективность такой трансформаци (трансфекции) достаточно велика и открывает широкие возможности для генно-инженерных манипуляций с иерсиниями. Приоритет в соответствующих разработках принадлежит автору настоящей монографии и его коллегам из ВНИИ биосинтеза белковых веществ [а. с. СССР № 2253466/0003/003 от 27.07. 78 г.; № 152324 от 19.07.79 г.; № 3047626 от 21.05.80 г. и др.], хотя об этом мало кто знает. Чтобы у читателя не возникло недоумение, предлагаем его вниманию очерки, в которых описаны причины подобной ситуации10. 3.5.3. Бактериофагия и трансдукция Бактериофаги, лизирующие чумной микроб, многократно выделяли из фильтратов бульонных культур, от животных и блох, из почвы нор и сточных вод, причём в местах, где Чумы давно не было [Pollitzer R., 1954]. В то же время, чумной микроб чувствителен к ряду фагов кишечной палочки и других бактерий. Сопоставление этих фактов вынудило Н. Н. Новосельцева и соавт. [1982] поставить вопрос: существуют ли "чумные" фаги на самом деле или приходится иметь дело с "кишечными" фагами, которые легко адаптируются к чумному микробу? Так или иначе, но фаги, пригодные для идентификации чумного микроба все же есть (например, фаги Д(Эреля, Покровской, Лариной), хотя их специфичность оставляет желать лучшего. Так, по данным Г. Г. Гурлевой [1959], помимо чумного микроба отдельные фаги, могут лизировать штаммы возбудителя псевдотуберкулёза, ряда видов кишечных бактерий и даже микрококков. В то же время чувствительность Y. pestis к чужеродным фагам при эпизоотологических обследованиях заставляет прибегать к помощи антифаговых сывороток (очевидно, они столь же неспецифичны, как и чумные фаги, которые используются для их получения). Еще больше запутан вопрос об умеренных фагах и лизогении у чумного микроба. Некоторые авторы, например, О. П. Плотников и соавт. [1982], несмотря на возражения [Домарадский И. В. и др., 1974; Новосельцев Н. Н. и др., 1977], продолжают утверждать, что чумные умеренные фаги существуют, хотя единственным доказательством в пользу этого служат особенности морфологии негативных колоний и способность "лизогенизированных" культур продуцировать фаг. Однако постоянное образование фага присуще также псевдолизогенным культурам, что в случае Y. pestis показано Б. Н. Мишанькиным и Ю. Г. Сучковым [1973], а сама по себе морфология негативных колоний является слишком спорным признаком. В общем, мы по-прежнему придерживаемся мнения, что лизогении у чумного микроба нет, чем он отличается от Y. enterocolitica и других иерсиний [Домарадский И. В., 1971; Calvo С., Brault J., 1983]. Почти 20 лет назад я с коллегами из ВНИИ биосинтеза белковых веществ занялся поисками гетерологичных фагов для передачи генов чумному микробу, т. е. для трансдукции. Теоретическим обоснованием этого послужили данные о неабсолютой специфичности многих фагов [Амиров Э. Я., Домарадский И. В., 1981]. В конечном итоге, мы остановились на общетрансдуцирующем фаге Р1; выбор был предопределен, в частности, результатами опытов D. A. Smith и T. Burrows [1962], выявившими общие рецепторы фага Р1 у кишечной палочки и чумного микроба. Вскоре выяснилось, что фаги Р1 (Р1vir и P1сlr) пригодны для наших целей (их применение оказалось весьма эффективным средством трансдукции. С помощью фагов Р1 от кишечной палочки чумному микробу были переданы различные плазмиды, в том числе неконъюгативные или те, которые нельзя было передать с помощью конъюгации из-за явления поверхностного исключения, хромосомные гены [а. с. СССР "Метка" № 2251932/0001/001 от 15.02.1978 г.], а также фаг лямбда, маркированный транспозоном [а. с. СССР № 2269917/0005/005 от 1.09.78 г.]. Ныне предложенный нами принцип трансдукции широко применяют другие авторы, как в России, так и за рубежом. 3.5.4. Аутохтонные плазмиды Косвенные указания на наличие собственных плазмид у чумного микроба были получены Е. Г. Кольцовой [1970], которой впервые удалась передача кишечной палочке пестициногенности от чумного микроба. Однако поиски их были заторможены утверждением R. Little и R. Brubaker [1972] о том, что чумной микроб плазмид не имеет. Тем не менее совместно с сотрудниками Кировского НИИЭГ, я все же продолжил соответствующие исследования. В моей лаборатории работали с вакцинными штаммами EV, 1 и 17, применяя для анализа ДНК электронную микроскопию, а в НИИЭГ использовали также вирулентные штаммы, а ДНК подвергали электрофорезу в агарозном геле. В результате совместных усилий плазмиды были обнаружены. Более того, удалось установить связь патогенности (вирулентности) чумного микроба с плазмидами, что нашло отражение в формуле открытия [диплом на открытие "Плазма" № 001 от 27.06.83 г. с приоритетом от 27.12.77 г., неопубликовано]. С тех пор факт наличия плазмид у чумного микроба и их связь с вирулентностью стали непреложной истиной. Заметим, что за рубежом первые подтверждения этого стали появляться только с 1980-1981 гг. Сейчас у чумного микроба основными считаются три плазмиды, которые кодируют свойства, указаннные в табл.14 и подробно описанные в разделе 3.8. Вместе с тем начинают появляются данные о наличии у чумного микроба других плазмид, функции которых полностью еще не вскрыты [Butler T., 1983; Tsukano H. A. et al.,1986]. Из числа основных плазмид чумного микроба постоянным атрибутом вирулентных штаммов Y. enterocolitica и Y. pseudotuberculosis. является только одна, мол. масса которой колеблется в пределах 45-47 мДа. [Portnoy D. A., Martinez R, 1985; Skurnik M., 1985; и др.] Все известные плазмиды чумного микроба и близкородственных иерсиний относятся к неконъюгативным. Передача их возможна только за счёт мобилизации гетерологичными конъюгативными плазмидами [Кольцова T. Г., 1970] или трандукции [собственные данные; Wolf-Watz H. et al., 1985]. Плазмидам иерсиний посвящено множество литературных источников и поэтому анализировать все относящиеся к ним данные здесь нет возможности. 3.6. "Мышиный" токсин По данным E. S. Baker и соавт. [1952], токсин чумного микроба входит в состав водорастворимых компонентов клетки, представляющих собой её поверхностные ("оболочечные") антигены; водонерастворимый же остаток клеток содержит "соматический" антиген, общий для микробов Чумы и псевдотуберкулёза (Sch(tze H., 1932). Из водного экстракта клеток токсин может быть осажден при 55-67 %-концентрации сульфата аммония ("фракция II" или FII). Характерной особенностью этого токсина оказалось то, что он вызывал гибель белых мышей и крыс, но не морских свинок. Поэтому его назвали "мышиным". Однако прежде чем перейти к рассмотрению последнего укажем, что помимо токсина в водном экстракте клеток содержится также капсульный антиген, который осаждается при более низкой концентрации сульфата аммония и поэтому еще называется "фракцией I" или "FI" (см. раздел 3.8.3). Мышиный токсин является белком, входящим в состав цитоплазматической мембраны. С помощью проточного электрофореза на бумаге он был разделен на два компонента ? субъединицы А и В. Субъединица А имеет мол. массу 240 кДа, а субъединица В (120 кДа и содержит значительно меньше триптофана, чем субъединица А. В свою очередь, при обработке SDS обе субъединицы распадаются на полипептиды с мол. массами от 12 до 24 кДа, которые сохраняют токсичность. Обе субъединицы отличаются высоким содержанием дикарбоновых аминокислот и низким содержанием цистеина. Однако для сохранения токсичности остатки цистеина очень важны, равно как важны и остатки триптофана. Удельная активность субъединицы А выше, чем таковая субъединицы В [Montie T. S., Ajl S. J., 1970; Montie T. C., Montie D. B., 1973]. Подобно любому белку мышиный токсин обладает антигенными свойствами. Очищенный токсин, смешанный с адъювантом Фрейнда, вызывает у кроликов образование антитоксина, способного нейтрализовать токсин из вирулентных и авирулентных штаммов чумного микроба. Токсин сенсибилизирует танизированные эритроциты, которые в реакции гемагглютинации могут служить для определения уровня антитоксина в крови, и связывает комплемент. Очищеннный токсин не вступает в реакцию с антикапсульными сыворотками, а антитоксин не реагирует с FI [Warren J. et al., 1955]. Однако антитоксические сыворотки не предохраняют против Чумы, а токсин нельзя превратить в настоящий анатоксин, хотя при соответствующей обработке он теряет токсичность и продолжает связываться со специфическими антителами. От таких истинных экзотоксинов, как, например, дифтерийный или столбнячный, мышиный токсин отличается еще двумя признаками. Во-первых, при его введении нет латентного периода (при надлежащей дозе действие проявляется сразу же), а, во-вторых, отсутствует прямая связь между вирулентностью и токсичностью культур. Кроме того, хотя в картине интоксикации, вызванной мышиным токсином, и много общего с картиной Чумы [Домарадский И. В., 1966; Sch(r M., Meyer K.,1956; Cocking E.C. et al., 1960], все же некоторые симптомы чумной интоксикации очень сходны с симптомами интоксикации, вызываемой эндотоксинами (табл. 15). На основании всего сказанного, мы не согласны с теми, кто , подобно T. Butler [1983], мышиный токсин называет "экзотоксином". Говоря о мышином токсине, нельзя не упомянуть о том, что некоторые авторы, например, О. А. Проценко и соавт. [1983], его генетический контроль связывают с плазмидой pFra, молекулярная масса которой лежит в пределах 61-65 мДа. 3.7. Эндотоксин В течение многих лет выделить эндотоксин чумного микроба ("полный антиген", как его называли раньше) никому не удавалось. Во всяком случае это не удалось ни G. Girard [1941; цит. по Коробковой Е. И. и др., 1944], независимо от того, имел ли он дело с вирулентными или авирулентными штаммами, ни Е. И. Коробковой и соавт. [1944], которые исследовали как шероховатные, так и гладкие колонии чумного микроба. Как считает T. Butler [1983], возможная причина этого заключалась в наличии у чумного микроба толстой белковой капсулы (FI), которая при применявшихся тогда методах мешала выделению эндотоксина. Проблему удалось решить лишь а 1956 г., когда D. A. Davies для извлечения липополисахарида (ЛПС) чумного микроба использовал водно-фенольную экстракцию. Препарат был свободен от белка и нуклеиновых кислот и содержал глюкозу, глюкозамин, альдопентозу, на долю которой приходилась большая часть остатка полисахарида Позднее этот сахар был идентифицирован как L-глицероманнопентоза [Foster A. B. et al, 1958] Химическое сходство ЛПС чумного микроба и ЛПС кишечной палочки было установлено D. S. Ellewood [1968], идентифицировавшим 3-дезокси-D-маннооктулозу (КДО) в составе ядра ЛПС чумного микроба. Липидная часть ЛПС чумного микроба была изучена R. V. Walker и соавт. [1966]. После щелочного гидролиза ЛПС с помощью тонкослойной хроматографии было выявлено кефалиноподобное пятно, напоминающее фосфатидилэтаноламин. Позднее J. L. Hartley и соавт. [1974] выявили липид А в чумном ЛПС, который подобно липидым компонентам других ЛПС обусловливает их токсичность. В состав чумного липида А входят глюкозамин, глюкозамин-6-фосфат, этаноламин и одна важная жирная кислота ((-оксимиристиловая. Как полагают авторы, структура ЛПС чумного микроба несколько проще структуры других ЛПС, вследствие преобладания в ней (-оксимиристиловой кислоты над другими жирными кислотами. Через 10 лет N. D. Venezia и соавт. [1985] вернулись к изучению липида А чумного микроба и точнее определили его состав у штамма EV40. Оказалось, что этот липид содержит связанные (-гликозидными (1R6) связями остатки D-глюкозамина, которые несут по две фосфатные группы. Различными методами показано, что остатки фосфатной кислоты соединены с 4-аминоарабинозильными остатками, а гликозидные фосфатные группы с D-арабинозофуранозильным остатком в ЛПС II и с фосфорилэтаноламином в ЛПС I. Гидроксильные группы дисахарида ацилированы додедекановой, гексадеценоевой, 3-окситетрадекановой и 3-додеканоилокситетрадекановой кислотами. Аминогруппы дисахарида несут 3-окситетрадекановую и 3-додеканоилокситетрадекановую кислоты. Кроме того, меньшие количества 3-тетрадеканоил-окситетрадекановой и 3-гексадеканоилокситетрадекановой кислот связаны эфирными связями. Нативный ЛПС чумного микроба сильно агрегирован и поэтому трудно определить его молекулярную массу. При ультрацентрифугировании он седиментирует при 29500 rpm, а под электронным микроскопом выглядит как нитевидная структура с диаметром около 8 нм. 3.8. Факторы вирулентности В противоположность токсинам, постоянным структурным компонентам клетки чумного микроба, его видовым атрибутам, факторы вирулентности относятся к числу фенотипических признаков, которые начинают проявляться в инкубационном периоде и достигают "расцвета" в разгар болезни [Butler T., 1983]. Здесь необходимо подчеркнуть, что хотя большая часть известных сейчас детерминантов вирулентности чумного микроба присуща также Y. pseudotuberculosis и Y. enterocolitica, их экспрессия осуществляется по своим, характерным для каждой иерсинии, законам. Учитывая сказанное, легко понять, почему, например, чумной микроб и его "двойник" (Y. pseudotuberculosis, вызывают столь непохожие заболевания. Считаю по-прежнему [Домарадский И. В. 1966], что основное отличие авирулентных штаммов чумного микроба от вирулентных заключается в способности последних распространяться и безудержно размножаться в организме. Это отличие между вирулентными и авирулентными штаммами можно иллюстрировать, в частности, результатами исследований G. M. Fukui и соавт. [1957]. Если микробы, выращенные при 26 (С, вводились морским свинкам аэрогенным путем, то большая часть авирулентных клеток отмирала в первые 6 ч.; элиминация клеток продолжалась и в последующем, но с меньшей скоростью. При аналогичных условиях число вирулентных клеток в первые часы также уменьшалось, но затем оно возрастало вплоть до гибели животных. Однако начальное отмирание вирулентных клеток не отмечалось, если для заражения брали культуры, изолированные от животных или выращенные при 37 (С на агаре из вытяжки сердца с добавлением глюкозы и сульфита. После долгих поисков, T. Burrows [1957] пришёл к ставшему общепризнанным выводу о том, что характерными признаками вирулентных штаммов чумного микроба являются: 1) наличие капсулы и V- и W-антигенов, 2) способность синтезировать пурины и 3) образование пигментированных колоний на среде с гемином. Позднее к ним были отнесены пестициногенность и неспособность расти на средах при 37 (С в отсутствии ионов кальция. С тех пор этот перечень факторов вирулентности не изменился. Только совсем недавно было предложено включить в него "pH-6-антиген" [Lindler L. E. et al., 1990], наличие которого раньше никак не связывали с вирулентность иерсиний. Однако постепенно стали накапливаються данные о том, что на самом деле проблема вирулентности гораздо сложнее. В первую очередь, мы имеем в виду сообщения о том, что штаммы, вызывающие вспышки Чумы у людей, и штаммы, циркулирующие в природных очага, по наличию известных факторов вирулентности не отличаются друг от друга. Следовательно, есть еще какие-то другие, о природе которых можно только гадать. 3.8.1. Потребность в ионах кальция и зависимость от температуры Этот раздел начинается с вопросов о потребности иерсиний в ионах кальция, поскольку она уникальна для прокариотов. Как установили K. Higuchi и соавт. [1959] для роста при 37 (С (но не 26 (С) в синтетической среде, содержащей оксалат магния (он связывает ионы кальция), вирулентные клетки чумного микроба не растут. В отличие от них авирулентные клетки обходятся без кальция (исключение составляет штамм EV). Однако потребность в Ca2+ появляется даже у авирулентных штаммов, если концентрация Mg2+ в синтетической среде падает с 0,02 до 0,0025 М. Очевидно, у авирулентных клеток потребность в Ca2+ покрывается достаточным количеством Mg2+. 11 С легкой руки Gоguen J. и соавт. [1984], процессы, протекающие в клетках иерсиний на средах без кальция при температуре 37 (С, теперь принято называть "low calcium response" или сокращенно "LCR". По данным R. J. Zahorchak и соавт. [1979], при 37 (С на среде без кальция резко падает мембранный заряд клетки и еще до прекращения синтеза белка выключается образование ДНК и РНК, причём при добавление кальция рост не восстанавливается. Многочисленными работами доказано, что зависимость иерсиний от наличия кальция неразрывно связана с присутствием у них плазмиды "вирулентности" (pCad), о которой говорилось выше. На этой плазмиде за зависимость от наличия кальция ответственна область, лежащая между генами lcrD и yscA-L, равная примерно 18,5 тыс. пар оснований, т. е. четверти всей плазмиды [Holmstr(m A., 1995]. Потребность в ионах кальция (сложный процесс, в реализации которого принимает участие большое число различных LCR-белков. Однако их набор у каждой из иерсиний весьма специфичен и "беднее" всего он у Y. pestis (см. ниже). Так или иначе, но все LCR-белки образуются в течение 2 ч. после прекращения деления клеток. Ионы кальция, взаимодействуя с один из LCR-белков, а именно YopN, передают внутрь клетки сигнал к инактивации репрессора (репрессоров), препятствующего экспрессии других белков, т. е. выступают в роли негативного регулятора транскрипции. В то же время температура 37 (С действует как позитивный регулятор через посредство LcrF, гомологичного активатору транскрипции AraC E. coli [Holmstr(m A, 1995]. Здесь уместно поэтому заострить внимание на особой роли температурного фактора в физиологии чумного микроба, которую можно считать для него очень характерной (у других иерсиний она так не выражена). Впервые обратили внимание на особую роль температурного фактора G. Hills и E. Spur [1952], столкнувшиеся с тем, что потребность чумного микроба в источниках питания оказалась гораздо выше при 37 (С, нежели при 28 (С. В последующем значение температуры было подтверждено другими исследователями, в частности, изучавшими ферментативную активность Y. pestis [Домарадский И. В. и др., 1974]. Именно при этом был выявлен необычный феномен (отрицательное влияние глюкозы ("токсичность") на рост вирулентных клеток при аэрации и температуре 37 (С (рис.10), что не имело место в присутствии ксилозы, галактозы или маннита. Но особенно заметно перепады температуры сказываются на вирулентности, что в конечном итоге и привело к возникновению понятия о LCR. Однако последнее, по нашему мнению, отодвигает влияние температуры на второй план, хотя для возникновения LCR температура не менее важна, чем нехватка кальция. Ведущую роль температурного фактора в вирулентности чумного микроба можно иллюстрировать следующими примерами. заимствованными из работ, о которых теперь мало кто помнит. По данным G. M. Fukui и соавт. [1960], из числа известных тогда детерминантов вирулентности, "главные" имели лишь культуры, которые выращивали при температуре 37 (С; они же обладали наиболее высокой вирулентностью (табл. 16). Однако, когда культуры, выращенные при 5 (С, подвергали инкубации при 37 (С и аэрации, то уже через 2 ч. вирулентность бактерий значительно увеличивалась, а через 8 ч. возрастала на два логарифма. Все это протекало на фоне отсутствия заметного увеличиения числа жизнеспособных клеток, что говорило о фенотипической модуляции вирулентности. Сходные результаты были получены и в опытах с морскими свинками. В работе H. B. Naylor и соавт. [1961] описаны условия, необходимые для восстановления вирулентности у "5-градусных" культур: инкубация в течение 6 ч. с аэрацией при 37-41 (С; наличие в среде ряда аминокислот, сбраживаемого сахара (ксилозы) и неорганического фосфата, присутствие глюконата, pH среды в пределах 5,5-8,4. Немаловажно, что к числу "восстанавливающих" факторов ионы кальция не относились! Как уже указывалось [Домарадский И. В., 1993], на основании многочисленных данных создается впечатление, что столь поразительная связь между температурой и свойствами чумного микроба может быть следствием тех двух фаз существования его в природе, которые постулировал М. Балтазар [1964]; находя у теплокровных животных все, в чем он нуждается, микроб теряет свою относительную неприхотливость, необходимую для персистенции во внешней среде, и переключает метаболизм на синтез факторов, позволяющих противостоять защитным силам организма. Поэтому приходится сожалеть, что, интимные механизмы поразительного влияния температурного фактора на различные стороны физиологии чумного микроба выпали из поля зрения исследователей и остаются нерасшифрованными. По нашему мнению, здесь следовало бы в первую очередь попытаться выяснить, в чем заключается специфика регуляции ферментативной активности чумного микроба, и осуществляется ли она при критических ситуациях путем изменения количества ферментов ("дирижеров" ключевых реакций) на уровне транскрипции или происходит за счет изменения их активности, т.е. степени изменения каталитического потенциала клетки. 3.8.2. VW-антигены (Vwa) У всех иерсиний были обнаружены V- и W-антигены, но сначала их нашли у чумного микроба [Burrows T. W., Bacon G. A., 1956b], Как считают, оба эти антигена вместе с FI или независимо от неё обладают антифагоцитарным действием и рассматриваются поэтому как факторы вирулентности чумного микроба. Фагоцитозу могут противостоять даже авирулентные VW+ штаммы, лишенные FI, а сыворотка против этих антигенов устойчивость чумного микроба к фагоцитозу снижает [Burrows T. W., Bacon G. A., 1956a]. C другой стороны, имеются указания на то, что V-антигенучаствует в процессах иммуносупрессии путем торможения синтеза цитокинов [Nakajama R. et al., 1995] Недавно получены также весьма убедительные доказательства значения V-антигендля иммунитета против Чумы. Выяснилось, в частности, что рекомбинантный V-антиген защищает мышей от заражения вирулентным штаммом чумного микроб [Leary S. et al., 1995]. Что касается W-антигена, то он может играть роль порина, способствующего выходу V антигена в окружающую среду, но в общем о нём мало что известно. По данным W. D. Lawton и соавт.[1963], V-антигенявляется белком с мол. массой 90 кДа, а W представляет собой липопротеин с мол. массой 145 кДа. Оба антигена стабильны как при 60(С (30 минут), так и в замороженном состоянии, но инактивируются при 80(С, длительном хранении при 5(С и лиофилизации. В процессе диализа против дистиллированной воды разрушается только W-антиген. V- и W-антигены содержатся в цитоплазматической фракции микроба. S. C. Straley и R. Brubaker [1982] изолировали пептиды, связанные с этими детермиантами вирулентности, путем разрушения клеток и разделения компонентов цитоплазмы и внешней мембраны. Благодаря тому, что эти антигены на поверхности не экспрессируются, предполагают, что с клеточными мембранами клеток хозяев они не взаимодействуют. Подобно другим белкам, о которых говорилось в предыдущем разделе, V- и W-антигены кодируются плазмидой pCad и экспрессируются только во время стаза; их синтез при делении клеток в присутствии избытка ионов кальция подавляется. Тем не менее считают, что после захвата бактерий фагоцитами оба антигена синтезироваться все же могут, так как в фаголизосомах концентрация кальция достаточно низка [Pollack et al., 1986]. Синтез V-антигена кодируется геном lcrV, входящим в состав оперона lcrGVH – yopBD, расположенном на плазмиде "вирулентности" [Bergman T. et al.,1991; Perry R. D. et al., 1986; ]. По данным S. Price и соавт. [1991], V-антиген является регуляторным бифункциональным белком, С одной стороны, он необходим для кальций-зависимого роста чумного микроба, а с другой (для максимальной экспрессии LCR-генов вирулентности. Говоря о Vwa, нельзя не вернуться к другим белкам, связнным с LCR, которые также относят к белкам вирулентности иерсиний. Все они относятся к числу поверхностных белков и выполняют разные функции в патогенезе инфекций: сигнализируют микробным клеткам о наличии ионов кальция (YopN) и изменении температуры (LcrF), выполняют ферментативные и регуляторные функции (YpkA, YopH), образуют поры в соответствующих клетках-мишенях и способствуют перемещению в них других белков ((YopK,YopB,YopD), дают цитотоксический эффект (YopE), нарушают агрегацию тромбоцитов (YopM) и др. [Guan K., Dixon J, 1990; Leung K. Y. et al.,1990; Bliska J. B. et al., 1991; Forsberg A. et al., 1991; Galyov E. et al., 1993; Holmstr(m A, 1995]. Из числа белков, кодируемых плазмидой pCad и участвующих в LCR, у чумного микроба выявлено 11, среди которых превалируют YopM и YopN [Leung K. Y. et al., 1990]. Одна из причин, с которой может быть связан относительно небольшой набор LCR-белков у чумного микроба, рассматривается ниже. Поскольку синтез всех LCR-белков неразрывно связан с pCad, необходимо заострить внимание на очень важном факте, который может помочь лучше понять, от чего зависят флюктуации вирулентности чумного микроба. Мы имеем в виду данные R. Zsigray и соавт. [1983,1985], показавших, что у штаммов Y. pestis, получивших F' lac, потеря вирулентности обусловливается встройкой pCad в хромосому. Встройка носит обратимый характер: pCad возвращается в автономное состояние, когда F' lac элиминируется из клеток. 3.8.3. Фракция I (капсульный антиген) Подобно многим другим микроорганизмам чумной микроб in vivo и при определенных условиях in vitro образует капсулу или оболочку. Однако, как подчеркивал T. Burrows (1960a), по вопросу о том, идентична ли капсула, образуемая микробом в организме, капсуле, которая образуется им на искусственных питательных средах, мало что известно. Начало интенсивному изучению капсульного вещества было положено работами . E. E Baker и соавт. [1952]. которые для её извлечения использовали водносолевой экстракт сухих клеток чумного микроба.12 На искусственных питательных средах максимальное количество FI в форме видимой капсулы накапливается при 37(С. При температуре 26-28 (C, оптимальной для роста чумного микроба, образование FI выражено значительно слабее. По многочисленным данным, штаммы FI- легко селекционировать из популяции FI+ при помощи специфической антисыворотки. Такие штаммы не образуют видимой капсулы, не агглютинируются капсульной антисывороткой, не высвобождают FI после обработки их ультразвуком и не вызывают образования соответствующих антител. Помимо явных FI+ и FI- штаммов встречается еще третий тип штаммов, обладающих свойствами как первого, так и второго типа (штаммы FI(). Штаммы FI(не способны к образованию видимой капсулы ни на питательных средах, ни в организме животных. Однако такие штаммы способности к синтезу FI полностью не лишены, о чем можно судить с помощью реакции преципитации в геле или по индукции ими специфических антител. Два таких штамма были получены путем селекции, а один выделен от человека, умершего от Чумы (штамм Bryan [Burrows T. W., Bacon, G. A., 1958]. По химической природе FI оказался белковым агрегатом с мол. массой 300 кДа, состоящим из двух компонетов с одинаковыми антигенными свойствами. Один из них, изоэлектрическая точка которого лежит при рН 4,6, соединен с олигомерным галактаном, т. е представляет собой гликопротеин, тогда как второй, с pI 4,8, является чистым белком. Оба компонента распадаются на субъединицы с мол. массами от 15 до 17 кДа [Bennet L., Tornabene T., 1974] и легко образуют исходный, высокомолекулярный комплекс. Упаковка молекулы FI происходит за счет водородных и гидрофобных взаимодействий без образования дисульфидных связей [Наумов А. В., Самойлова Л. В., 1995]. B-клеточный эпитоп, доступный для антител, выглядит как гидрофильная петля на поверхности полимерной молекулы [Zav'yalov V. et al., 1995a]. Что касается генетического контроля синтеза FI, то , по данным ряда авторов, например О. А. Проценко и соавт. [1983], он осуществляется "крупной" плазмидой (pFra), молекулярная масса которой колеблется от 60 до 65 мДа. Фрагмент pFra Y pestis EV, непосредственно связанный с синтезом FI, (оперон fI (недавно был детально изучен. Он оказался относительно небольшим (около 4 мДа) и включает в себя 4 гена (рис. 11). Клетки кишечной палочки, несущие рекомбинантную плазмиду с цельным опероном fI, образуют капсулу, содержащую FI [Karlyshev A. et al., 1996]. Примечательно, что эти клетки обладают способностью связывать интерлейкин 1((hiL?1(), причём ответственным за связывание является белок CaFIA; этот факт должен учитываться при анализе роли капсульного вещества в патогенезе Чумы [Zav'yalov V. et al., 1995b] . Казалось бы, все ясно. Однако у штамма Yreka в образовании FI может участвовать плазмида с мол. массой 13 мДа, отсутствующая у других штаммов чумного микроба [Tsukano H et al.,1986]. Чтобы убедиться в этом, японские авторы прибегли к помощи комбинации элиминирующих плазмиды агентов и получили клетки штамма Yreka, которые наряду с указанной и еще четырьмя плазмидами утратили поверхностный капсульный материал [Tsukano H., 1989]. Но полученные клетки оказались неоднородными; одни были лишены FI, a другие напоминали штаммы FI(и содержали FI, но только в цитоплазме. Поскольку оба типа клеток были бесплазмидными, авторы пришли к выводу, что именно плазмида с мол. массой 13 MД связана с появлением поверхностного капсульного антигена и не имеет отношения с синтезу внутриклеточного антигена. Дополнительные опыты дали указание на наличие каких-то других генетических элементов, кодирующих образование внутриклеточной FI. Вопрос о генетическом контроле синтеза FI окончательно решеным считать нельзя. Помимо сказанного и собственных неопубликованных данных, в этом нас убеждают также результаты исследований других авторов, в частности, M. S. Zhao и соавт. [1990]. По мнению последних, соответствующие гены располагаются на транспозоне. Иначе трудно объяснить тот факт, что у одних штаммов чумного микроба гены FI связаны с крупной плазмидой, а у других (с хромосомой. И еще один вопрос, на который предстоит ответить: если синтез FI действительно связан со столь небольшим фрагментом pFra, как утверждают A Karlyshev и соавт., то что же кодирует остальная часть этой неконъюгативной плазмиды? Мышиный токсин, о чём пишут другие авторы? Как нам кажется, ответы на поставленные вопросы принципиально важны, поскольку они помогут понять причину, породившую сомнения в FI, как в одном из факторов вирулентности чумного микроба [Davis K. J. et al., 1996]. 3.8.4. pH6-антиген pH6-антиген (pH6Ag) был описан S. Ben-Efraim и соавт. [1961]. Они показали, что этот антиген образуется чумным микробом in vitro и in vivo при 37 (С и рН ниже 6,7, т. е. при условиях которые сходны с таковыми в фаголизосомах и абсцессах. По данным L. Bichowsky-Slomnicki и S. Ben-Efraim [1963], этот антиген сообщает клеткам чумного микроба большую стабильность в суспензиях, агглютинирует эритроциты и обладает цитотоксичностью, что может иметь непосредственное отношение pH6Ag к вирулентности, поскольку мутации в хромосомном структурном (psaA)или регуляторном (psaE) гене приводят более чем к 100-кратному увеличению ЛД50 [Linder L. E. et al., 1990]. pH6Ag образует фимбриоподобные поверхностные структуры, построенные из субединиц с мол. массой 15 кДа. Их образование индуцируется внутри макрофагов. Небезынтересно, что в отличие от гена psaA, "работа" гена psaE не зависит от температуры и pH среды. Одной из особенностей этих структур (белка PsaA является их способность играть роль Fc-рецепторов; они связываются с нормальными IgG человека, что приводит к возникновению псевдоиммунных комплексов, и, как следствие, к антигенной мимикрии [Zav'yalov V. et al, 1996]. Возможно, что утрата вирулентности в опытах L. E. Linder и соавт. [1990] обусловливалась именно тем, что их мутанты не могли "обманывать" иммунную Систему организма, как это делают неизмененные штаммы. С помощью ДНК гибридизации и иммуноблотинга антиген, подобный pH6-антигену, выявлен у возбудителя псевдотуберкулёза [Linder L. E., Tall B. D., 1993], у которого он также связан с вирулентностью [Muhr J., 1993; цит. по Holmstr(m A., 1995]. Кроме того, 44 %-гомология с pH6-антигеном была обнаружена у Myf-белка (мукоидного фактора) Y. enterocolitica [Iriate M. et al., 1993]. В то же время, хромосомные локусы, кодирующие pH6-антиген и Myf-белок, имеют сходство с локусами Pap-пилей кишечной палочки (papC papD, ответственными за транспорт и сборку субъединиц пилина, что интересно с эволюционной точки зрения. 3.8.5. Потребность в железе и пигментация При изучении потребностей в источниках питания авирулентного штамма FS и его вирулентного мутанта MP6 было замечено [Jackson S., Burrows T. W., 1956], что оба штамма на синтетической среде с гемином образуют пигментированные колонии. После 4-дневной инкубации от пигментированных колоний (Р+) отщепляются вторичные непигментированные колонии (Р-), которые остаются непигментированными и в последующих генерациях (превращение штаммов Р- в Р+ никогда не происходит). Как установил [Burrows T. W., 1960 a , b], превращение штамма Р+ в штамм Р- сопровождается потерей вирулентности для мышей, даже если штамм Р(сохраняет способность к образованию других детерминантов вирулентности. Потеря вирулентности, связанная с утратой способности образовывать пигментированные колонии на среде с гемином, оказалась обратимой и полностью восстанавливалась, если штамм P- (c другими детерминантами вирулентности) вводили мышам вместе с нетоксичными дозами гемина или солей железа. В опытах на морских свинках этот эффект проявлялся слабее. Заменить соли железа солями других металлов не удалось. Железо не возвращало вирулентность пигментированным авирулентным штаммам, например, P+ FI+ VW-, и их непигментированным мутанатам P- FI+ VW- [Jackson S., Burrows T. W., 1956]. Эти данные в последующем были подтверждены многими другими авторами, в частности Л. А. Аваняном [1974] и, таким образом, потребность в от железе стали рассматривать как еще одну детерминанту вирулентности чумного микроба. Утрата вирулентности при превращении штаммов с фенотипом Р+ в P- скорее всего связана с потерей ими сидерохромов, необходимых для обеспечения клетки железом. Однако вопрос о происхождении их у штаммов P+ остается неясным. Одни считают, что Y. pestis обладает способностью к их синтезу [Wake A. et al., 1975], а другие полагают, что чумной микроб "заимствует" чужие хромофоры [Butler T., 1983]. Так или иначе, но обе гипотезы объясняют способность Y. pestis к размножению в животных тканях, содержащих свободное железо в критических концентрациях. Однако нуждается в дальнейшем изучении и вопрос о механизме влияния in vivo гемина или железа на штаммы Р-. Говоря о значении ионов железа для вирулентности чумного микроба, нужно обратить внимание еще на одно обстоятельство, а именно на способность всех иерсиний при дефиците железа в окружающей среде образовывать новые полипептиды. Два из них, обладающие большой мол. массой (HMWPs), синтезируются de novo только высоковирулентными штаммами и располагаются во фракции внешних мембран. Интересной особенностью HMWPs является то, что все они имеют общие эпитопы [Carniel E. et al., 1989]. К этому добавим, что необходимые условия для синтеза HMWPs имеются в организме всех животных и человека. Судя по всему, образование HMWPs коррелирует с признаком пигментообразования у чумного микроба, а очищенные HMWPs подавляют продукцию макрофагами кислородных радикалов, По данным H. Tsukano и сотр [1986], ген, ответственный за признак Р+, трудно "привязать" к одной из плазмид. Этот ген удалось передать штамму Р- с помощью "вспомогательной", конъюгативной плазмиды RP4, что свидетельствует о его хромосомном происхождении. Полученный рекомбинантный штамм восстановил вирулентность для мышей. Недавно получены новые доказательства хромосомной локализации pgm локуса, протяженностью в 102 т.п.н., а также новые данные о связи Pgm c чувствительностью к пестицину (см. раздел 3.8.7) [Lucier T. S. et al., 1996]. 3.8.6. Независимость от пуринов К числу важных особенностей вирулентных штаммов чумного микроба относится их способность к синтезу пуринов (Pu+); мутация в направлении утраты этой способности (Pu-) сопровождается потерей вирулентности для животных без изменения других свойств микроба. Авирулентность отдельных штаммов Pu+ объясняется, вероятно, отсутствием у них других детерминантов вирулентности. Например, у штамма TS нет антигенов V и W (Pu+ FI+ P+ VW-), а штамм EV лишен способности к образованию пигмента на среде с гемином (Pu+ F!+ P- VW+) [Burrows T. W., 1955, 1960 a , b]. Введение соответствующего пурина животным вместе со штаммами Pu- восстанавливает их вирулентность (при этом у мышей отмечается генерализованная инфекция: в отсутствии же экзогенного пурина из органов забитых животных высевается микробов меньше, чем вводится. Предполагается, что штаммы Pu- лишены ферментов, необходимых для синтеза пуринового кольца из его предшественников. У штаммов Pu- блок в синтезе пуринов, расположенный на пути к синтезу инозин-монофосфата, можно обойти путем добавления гипоксантина, причем вирулентность таких штаммов снижается незначительно. Наоборот, при нарушении образования аденина и гуанина снижаение вирулентности более выражено. In vivo такие мутанты утилизируют аденин или гуанин, рибо- и дезоксинуклеозиды, но не нуклеотиды. Я не знаю ни одного случая, когда при элиминации известных плазмид терялся бы признак Pu+. Следовательно, его фенотипическое выражение связано с хромосомным контролем. Здесь уместно напомнить, что независимость чумного микроба от азотистых оснований была установлена еще в начале 50-х годов [Домарадский И. В., 1956]. Правда, связь признака Pu+ с вирулентностью осталась тогда за кадром. Некоторые особенности метаболизма азотистых оснований у чумного микроба служили уже предметом специального обсуждения [Майский В. Г., 1986]. 3.8.7. Пестицин R. Ben-Gurion и I. Hertman [1958] описали наличие у чумного микроба первого бактериоцина (пестицина. Позднее R. Brubaker и M. J. Surgalla [1961] выявили еще один пестицин. Теперь их обозначают, как P1 и P2 соответственно. P1 образует большинство штаммов чумного микроба, но не возбудителя псевдотуберкулёза, а продукция P2 характерна для всех штаммов как Y. pestis, так и Y. pseudotuberculosis. По индукции ультафиолетовым светом, отношению к трипсину, зависимости от температуры и некоторым другим свойствам оба пестицина сходны. Однако между ними есть и принципиальное отличие: образование P2 кодируется хромосомой (наши данные), а гены P1 ("pst") локализованы на плазмиде Pst. Активность обоих пестицинов нейтрализуется сыворотками против микробов Чумы и вирулентного штамма возбудителя псевдотуберкулёза. Тем не менее R. Brubaker и M. J. Surgalla (1961) считали, что роль антител сводится лишь к блокаде рецепторов соответствующих бактериоцинов, а на сами пестицины антитела не влияют. Основанием для подобного заключения послужило, в частности, аналогичное действие на пестицины сывороток против непестициногенных штаммов Y. pestis. К P1 чувствительны штаммы серотипа I Y. pseudotuberculosis, штаммы чумного микроба, не образующие P1, и отдельные штаммы P1 этого микроба; последние обычно плохо растут, возможно из-за чувствительности к продуцируемому ими бактериоцину. В отличие от P1 второй пестицин действет лишь на немногие P1- негативные штаммы Y. pestis (табл. 17). Связь между P1 и вирулентностью служила предметом многочисленных исследований. При этом было установлено, что все мутанты чумного микроба, потерявшие способность продуцировать P1, становятся авирулентными, хотя некоторые авирулентные штаммы образуют P1. В этом отношении заслуживает упоминания работа И. Л. Мартиневского (1969). Согласно его данным, пестицин образуют штаммы чумного микроба, выделенные в Среднеазиатском и Волго-Уральском очагах, Дагестане, Забайкалье, Горном Алтае, а также в "океанических" очагах. Штаммы изолированные в Теджен-Мургабе (Туркмения) и Закавказском нагорье его не образуют. Близкие результаты были получены также Н. Н. Новосельцевым [1967]. Он показал, что штаммы от полевок и их блох из очагов Нагорного Азербайджана и Армении могут служить только индикаторами пестицина. Напомним, что именно полевочьи штаммы отличаются "избирательной" вирулентностью, на что мы указывем, говоря ниже об отсутствии у них фибринолизин-коагулазной Системы. Вирулентность пестициннегативных мутантов чумного микроба повышается у мышей, которым вводятся ионы трехвалентного железа для насыщения трансферина крови. Предполагается, что ионы железа скорее всего тормозят образование перекисных соединений в профессиональных фагоцитах, что способствует выживанию в них бактерий [Brubaker R. et al., 1965]. Нечувствительность подавляющего большинства P1+ штаммов чумного микроба к собственному пестицину привело к заключению о наличии у них фактора, сообщающего иммуность к нему, что характерно для типичных бактериоцинов [Brandis H., (marda J. 1971; Reeves P.,1972]. Этот фактор действует на пестицин подобно ингибитору, от которого первый удалось частично освободить [Brubaker R., Surgalla M. J.,1962]. Поскольку наличие ингибитора может препятствовать выделению и идентификации чумного микроба, E. D. Beesley и M. J. Surgalla [1970] предложили специальную среду, содержащую ЭДТА и избыток ионов кальция, которые подавляют активность ингибитора. Пестицин 1 (мономерный цитоплазматический белок с мол. массой около 63 кДа. В отличие от ряда бактериоцинов, P1 не подавляет синтеза ДНК, РНК и белка, а как показано R. Hall и R. Brubаker [1978], его действие на чувствительные бактерии сводится к превращению их в нежизнеспособные осмотически стабильные сферопласты, что связано с гидролизом муреинлипопротеинов. Таким образом, Р1 является ферментом (N-ацетил-(-глюкозаминидазой [Feber D. M., Brubaker R., 1979].13 3.8.8. Фибринолизин и плазмокоагулаза Оба свойства чумного микроба, отличающие его от двух других иерсиний, к числу "классических" факторов вирулентности не относятся. Тем не менее, по нашему мнению, они имеют непосредственное отношение к патогенезу Чумы. Есть и другие основания рассматривать их именно в этой главе (см. ниже). Анализируя особенности патологической анатомии при Чуме, В. Н. Лобанов [1956] писал: "Почти все исследователи отмечают, что при окраске органов на фибрин они или получали отрицательные результаты, или обнаруживали фибрин в незначительных количествах". Говоря о первичной легочной Чуме он вновь подчеркивал, что "авторами ряда работ было отмечено полное или почти полное отсутствие фибрина в легких…". Собственные исследования В. Н. Лобанова привели его к подобному же заключению. Особый интерес представляют указания на отсутствие фибрина при Чуме даже в тромбах, расположенных в капиллярах и сосудах большого калибра [Кишенский Д. П. и др., 1911; Лобанов В. Н. , 1956; Albrecht H., Gohn A., 1898]. Вполне естественно поэтому, что давно уже возникло подозрение о наличии у Y. pestis фибринолизина. В конце концов это подтвердил Madison [1936; цит. по Pollitzer R., 1954]. По его данным, наиболее чувствительным к фибринолитическому фактору чумного микроба оказался фибрин крысы. Приблизительно в 6 раз менее чувствителен был фибрин человека и морской свинки. Еще большей резистентностью обладал фибрин земляной белки, а также кошки, кролика, коровы и, наконец, обезьяны. Фибрины лошади, барана и свиньи не лизировались вовсе. Позднее заключение Madison о способности чумного микроба лизировать фибрин было подтверждено другими авторами. Изучив 114 штаммов чумного микроба различного происхождения и различных сроков хранения, из которых 4 штамма оказались фибринолитически неактивными, Г. А. Яромюк [1964] пришла к выводу, что фибринолитическая активность является одним из наиболее постоянных свойств чумного микроба, присущих как высоко-, так и слабовирулентным штаммам. В отличие от чумного микроба возбудитель псевдотуберкулёза способностью к фибринолизу не обладал, Последнее заключение было сделано на основании изучения 62 штаммов, из которых 28 были музейными, а остальные свежевыделенными. Более детальные исследования [Домарадский И. В., Г. А. Яромюк, 1960] привели к выводу о тесной связи чумного фибринолизина с микробной клеткой, чем он существенно отличается от стрептокиназы и стафилокиназы. Как показали наши последующие опыты, фибринолизин чумного микроба сохраняется при лиофилизации клеток и является весьма термостабильным фактором. В этом отношении он оказался сходным со стрептокиназой. Исследования чувствительности свободного от сыворотки крови фибрина и фибрина плазмы к фибринолитическому фактору чумного микроба выявило существенные отличия в степени лизиса этих субстратов. Фибрины крови человека и животных, полученные коагуляцией очищенных фибриногенов гомологичными тромбинами, лизировались чумным микробом независимо от их видовой принадлежности. Фибринолитический фактор чумного микроба вызывал лизис не только фибрина, но и фибриногена, который превращался в несвертывающийся под действием тромбина белок. В противоположность очищенному неочищенный фибрин человека из животных обнаруживал резкие видовые колебания чувствительности к фибринолитическому фактору чумного микроба. Например, неочищенный фибрин человека, морской свинки и кролика лизировался сравнительно легко, тогда как лизис неочищенного фибрина свиньи или барана происходил только в присутствии очень большого числа клеток чумного микроба. Неодинаковую чувствительность неочищенного и очищенного фибрина чкловека и животных к фибринолитическому фактору чумного микроба мы связали с наличием в сыворотке крови фибринозащитных субстанций или ингибиторов плазмина ? фибринолитического фермента крови, концентрация которых в крови человека и животных колеблется в широких пределах. Как показали наши опыты, ингибиторы плзмина в крови животных, невосприимчивых к Чуме, маскируют истинную чувствительность их фибрина к фибринолитическому действию чумного микроба.14 Фибринолизин чумного микроба нам удалось солюбилизировать растворами тиоционата калия по Эмису или с помощью мочевины и доказать при этом отсутствие его связи с одним из токсинов. Это же дало возможность приступить к выяснению механизма действия фибринолизина. В итоге многочисленных опытов было показано, что на самом деле фибринолизин чумного микроба не является фибринолизином как таковым, а относится к числу активаторов плазминогена. Однако как активатор плазминогена он отличается от стрептокиназы и стафилокиназы: стрептокиназа для активации плазминогена быка нуждается в присутствии проактиватора, содержащегося в человеческой крови, а стафилокиназа вообще не активирует бычий плазминоген. Напротив, чумной "фибринолизин" обнаруживал большое сходство с активаторами плазминогена, которые встречаются в тканях животных [Яромюк Г. А., Домарадский И. В., 1960]. В настоящее время результаты наших работ по чумному "фибринолизину" признаны во всем мире и рекомендуются даже в качестве диагностического теста [Bahmanyar M., D. C. Cavanaugh, 1976].15 После выявления у чумного микроба внехромосомных генетических элементов было установлено, что вирулентность чумного микроба неразрывно связана с наличием у него самой мелкой пазмиды, положение на которой гена "фибринолизина", точно локализовано нашим учеником А. Л. Мельниковым [дис. …канд. биол. наук., закрытая, 1987] и многими другими исследователями в Россси и за рубежом. Тогда же было установлено, что один и тот же ген pla кодирует образование активатора плазминогена и плазмокоагулазы [Sodeinde O. A., Goguen J. D., 1988]. Имеет ли "фибринолизин" отношение к тем патологоанатомическим находкам при Чуме, о которых говорилось выше, до сих пор не ясно Однако его значение для патогенности чумного микроба становится все более явным. На одну из возможных функций фибринолизина указала еще Г. А. Яромюк [1964]. Ссылаясь на литературные данные об участии плазмина в повышении проницаемости тканей. она писала, что "фибринолизин" не только участвует в "локальном фибринолизе в очагах воспаления, но играет также роль "фактора распространения". Эта гипотеза хорошо восполняла тот пробел в наших знаниях о чумном микробе как о высокоинвазивном микроорганизме, который возник после доказательства отсутствия у него гиалуронидазы [Домарадский И. В., 1966]. И эта точка зрения разделяется зарубежными авторами. Так, например, меньшую, чем у чумного микроба инвазивность возбудителя псевдотуберкулёза, R. Brubaker [1967] объяснял отсутствием у него "фибринолизин-коагулазных" энзимов. Прямые указания на значение pla гена для вирулентности чумного микроба получены O. A. Sodeinde и соавт. [1992]. Для мышей клетки чумного микроба, утратившие плазмиду с мол. массой 9,6 т.п.о., но несущие клонированный ген pla, оказались столь же вирулентными, как и клетки с этой плазмидой. Далее выяснился весьма любопытный факт, биологическую целесообразность которого объяснить не так легко. Дело в том, что, как уже указывалось, присущая всем иерсиниям плазмида (pCad, обладает набором детерминантов для синтеза LCR-белков. Однако у возбудителя Чумы набор этих белков всегда бывает намного меньше, чем у Y. pseudotuberculosis и Y. enterocolitica. Как оказалось, причина этого кроется в наличии другой плазмиды (Pst, а точнее, в кодируемом ею активаторе плазминогена, которому и приписывают участие в посттрансляционной деградации белков внешней мембраны [Sodeinde O. A. et al., 1988]. Мутации в гене pla предотвращают этот процесс, а штамм с клонированным геном pla, столь же "агрессивнен", как и штамм с плазмидой Pst. По данным R. Brubaker и соавт. [1987], то же происходит с V-антигеном чумного микроба, который в процессе очистки распадается на антигены с меньшей молекулярной массой. Каким образом активатор плазминогена вызывает деградацию белков, нам пока не понятно. Однако O. A. Sodeinde и соавт. [1992] называют продукт гена pla "активатором плазминогена с необычными кинетическими свойствами", который может даже расщеплять в специфических участках компонент С3 комплемента. Относительно недавно наши работы о чумном активаторе плазминогена получили неожиданное развитие. Как установил К. Kuusela [1996], на поверхности таких клеточных структур, как фимбрии и флагеллы кишечной палочки или М-подобные белки ряда грамнегативных и грампозитивных бактерий имеются специфические рецепторы плазминогена. Связывание с этими рецепторами не препятствует активации плазминогена соответствующими активаторами и превращению его в плазмин. Одновременно эти рецепторы связывают ингибитор-2 плазмина и макрогдобулин-2. Данные о том, что расположенный на поверхностях клеточных структур плазмин позволяет бактериям in vitro разрушать внеклеточные матричные структуры и проникать сквозь искусственные мембраны, позволяют рассматривать прокариотические рецепторы плазмингена как новый патогенетический фактор или фактор вирулентности бактерий. Поскольку фибринолиз, обусловленный чумным микробом, тесно связан с его способностью вызывать также коагуляцию плазмы крови, целесообразно здесь же рассмотреть и этот вопрос. Впервые способность чумного микроба вызывать свертывание плазмы крови была установлена E. Jawetz и K. Meyer [1944]. По их данным, эта способность Y. pestis выявляется только при использовании плазмы крови кролика и морской свинки. Так как E. Jawetz и K. Meyer испытывали лишь цитратную плазму, D. M. Eisler [1961; цит. по Домарадскому И. В., 1966] изучил процесс свертывания более подробно. В итоге он установил следующее: 1) авирулентный штамм чумного микроба А1122 свертывал неразведенную плазму крови человека, стабилизированную цитратом или оксалатом, и не вызывал этого эффекта в гепаринизированной плазме; 2) разведенная цитратная плазма (1:10) также подвергается свертыванию, хотя и менее полному и в более поздние сроки, чем неразведенная плазма, в то время как разведенная оксалатная плазма не коагулировала вовсе;3) наибольшей коагулазной активностью отличались культуры чумного микроба, выращенные на сердечно-мозговом бульоне; 4) оптимальной являлась концентрация цитрата, равная 2 мг на 1 мл плазмы; 5) коагулазная активность свойственна только микробным клеткам; в фильтратах бульонных культур она не обнаруживается.16 Помимо штамма А1122, коагулазная активность была констатирована D. M. Eisler у 23 штаммов чумного микроба, но какой-либо связи её с вирулентностью отметить не удалось. Поскольку фибринолитическая и плазмокоагулирующая активность чумного микроба направлена на один и тот же субстрат, представлялось интересным исследовать взаимосвязь между этими видами активности у различных штаммов чумного микроба. Для этой цели нами была использована в основном цитратная плазма человека, кролика и морской свинки [Домарадский И. B. и др., 1963б]. Всего для опытов было взято 116 фибринолитически активных и 57 неактивных штаммов чумного микроба различного происхождения, сроков хранения и вирулентности. Результаты наших опытов широко известны. Поэтому останавливаться подробно на них мы не будем. Однако на данных следует заострить внимание. Прежде всего, важно подчеркнуть, что фибринолитическая активность чумного микроба всегда сопровождается его способностью коагулировать плазму и наоборот. Раньше это было довольно трудно понять, но теперь, спустя годы, объяснение нашлось: ведь тот и другой признак чумного микроба кодируется одним и тем же геном pla плазмиды Pst. Благодаря этому стали понятны еще два факта, а именно причина одновременной утраты обоих признаков и характер связи их с вирулентностью чумного микроба. Более того, сейчас мы уже можем объяснить отсутствие фибринолизин-коагулазной Системы у полевочьих штаммов чумного микроба из закавказского высокогорного очага Чумы, отличающихся "избирательной вирулентностью". . Данные о том, что ген pla кодирует синтез фибринолизин-коагулазной Системы чумного микроба недавно послужил поводом для очень интересной гипотезы. По мнению K. A. McDonough и S. Falkow [1989], продукт гена pla является одним и тем же белком, а появление у него той или иной активности осуществляется на посттрансляционном уровне и зависит от температуры среды: появлению коагулазной активности способствует температура ниже 25 (С, а фибринолитической (выше 30 (С. Авторы не исключают, что альтернативные формы продукта гена pla необходимы микробу для блокообразования у блох, связанного со свертыванием крови, и заражения животных, при котором сгусток должен лизироваться. К сожалению, ни Г. А. Яромюк, ни другим исследователям расшифровать механизм свертывания плазмы чумным микробом не удалось. Сама же Г. А. Яромюк усматривала некоторое сходство между этим процессом и тем, который наблюдается при наличии коагулазопозитивных стафилококков. Если бы это подтвердилось, то можно было бы говорить о чумной коагулазе, как о своего рода активаторе протромбина или аналоге тканевых тромбопластинов. Наконец, следует подчеркнуть, что фибринолизин-коагулазная Система чумного микроба неразрывно связана с его способностью образовывать пестицин 1, что впервые было установлено Е. Г. Кольцовой. Ей же, как указывалось выше, принадлежит заслуга передачи всех трех признаков от чумного микроба кишечной палочке. 3.9. Принципы лабораторной диагностики чумы 3.9.1. Микроскопия и выделение культуры При исследовании любого подозрительного материала применяют микроскопию, посевы на питательные среды и постановку биопроб, а для поисков больных чумной грызунов в природе и для ретроспективной диагностики Чумы (в том числе у людей) (серологические методы (см. раздел 4.6). Для идентификации применяют разнообразные методы, позволяющие возможно полнее охарактеризовать выделенную культуру. Микроскопия до сих пор не утратила своей ценности. Во время вспышек среди людей или эпизоотий он часто даёт возможность поставить предварительный диагноз по наличию в мазках биполярно окрашенных микробных клеток (рис. 6 и 7). Для этого лучше всего окрашивать мазки синью Лёффлера или краской Wayson. Очень важно, чтобы мазки готовили и фиксировали как можно быстрее после взятия материала. Иначе биполярная окраска становится менее заметной. Кстати, биполярно окрашиваются клетки не только чумного микроба, но и некоторых других грамотрицательных бактерий, например, Pasteurella multocida [Домарадский И. В., 1971], а потому при массовых исследованиях грызунов и блох на Чуму нецелесообразно применять "классическую" микроскопию [Голубинский Е. П. и др., 1989]. Заслуживает внимания флюоресцентно-серологический метод, обладающий высокой чувствительностью, а подчас и специфичностью (особенно в непрямом варианте). Однако для его осуществления необходимы люминесцентный микроскоп и надлежащие диагностикумы. Последние представляют собой меченные флюоресцеин-изотиоционатом натрия кроличьи антитела к капсульному антигену чумного микроба (для прямого варианта) или немеченные антитела к капсульному антигену и меченые антикроличьи иммуноглобулины (для непрямого варианта). Как и при обычной окраске, чумной микроб выявляется в мазках, приготовленных из материала от больных, из органов животных или эктопаразитов, но только результаты при этом оценивают по яркости люминесценции. Специфичным считается свечение с яркостью в 4 или 3 "плюса". К числу недостатков флюоресцентно-серологического метода следует отнести его ненадежность в случае атипичных штаммов. От этого недостатка A. Phillips и соавт. [1988] пытались избавиться путем замены поликлональных антител моноклональными (в прямом варианте), однако свечение оказалось очень слабым. В то же время П. И. Анисимов и соавт. [1983] утверждают, что моноклональные антитела выявляют только чумной микроб и "не реагируют в рабочем разведении с близкородственными в антигенном отношении бактериями" (даже в прямом варианте). В настоящее время люминесцентный метод используется лишь в стационарных условиях, когда есть возможность предварительно подращивать уже изолированные культуры при температуре 37 (С, от чего метод теряет "экспрессность" и превращается в один из способов идентификации. Исследование материала путем посевов остается основным способом диагностики Чумы, но эффективность этого метода во многом зависит от качества питательных сред. Поэтому надежнее всего использовать стандартные питательные среды. Из числа питательных сред при анализах на Чуму рекомендуется применять питательный агар типа Хоттингера или Мартена, кровяной агар или агар из настоя бычьего сердца и соответствующие бульоны [Наумов А. В., Самойлова Л. В., 1992; Bahmanyar C., Cavanaugh D. С., 1976] . Кроме того, особенно в полевых условиях, ВОЗ рекомендует дезоксихолатный агар, так как при этом не требуется стерилизации и чумной микроб может быть изолирован даже при комнатной температуре. Для повышения "чувствительности" плотных питательных сред в качестве стимуляторов роста чумного микроба часто добавляют гемолизированную кровь и сульфит натрия, а для подавления посторонней микрофлоры (протея и некоторых других бактерий) (геницианвиолет или борную кислоту [Туманский В. М., 1958; Николаев Н. И., 1968; Апарин Г. П., Голубинский Е. П., 1989]. Если же в исследуемом материале предполагается наличие бактериофага, могущего помешать выделению Y. pestis, то посевы производят на плотные среды с антифаговой сывороткой (2 капли сыворотки тщательно растирают по поверхности агара). Обычно загрязненный материал (мокрота, пунктаты из бубонов, кусочки органов от трупов и грызунов и пр.) наносят на плотные среды, поскольку в жидких средах чумной микроб не выдерживает конкуренции с посторонней микрофлорой. В жидкие среды засевают только кровь, взятую с соблюдением правил асептики; при этом соотношение объема крови и бульона должно быть не менее 1:10. Посевы инкубируют при температуре 37 (С [Bahmanyar C., Cavanaugh D. C., 1976] или 26-28 (С [Николаев Н. И., 1968; Апарин Г. П., Голубинский Е. П., 1989] и просматривают их каждый день. При наличии чумного микроба уже через 12-14 ч. на плотных средах отмечается его рост в виде "битого стекла" и мелких, плоских, прозрачных колоний ("кружевных платочков"; через 24-48 ч. появляются оформленные колонии (рис. 8). На дезоксихолатном агаре рост становится заметным не ранее 2 сут., когда обнаруживаются мелкие, красноватые колонии. Первые признаки роста в бульоне (нежные хлопья на дне пробирки; они появляются позже, чем рост на агаре. Для выделения культуры каплю бульона растирают по поверхности плотных питательных сред. Остановимся еще на одном из методов, который позволяет быстро, в момент выделения, отличить неполевочью разновидность чумного микроба от его "двойника" (Y. pseudotuberculosis. Для этого поверх колоний на плотную питательную среду наливают тонкий слой того же, но полужидкого (0,7 %), агара , в который предварительно вносят культуру штамма Y. pseudotuberculosis серотипа I и чашки инкубируют 24 ч. при температуре 37 (С. Отбирают колонии с первого слоя среды, вокруг которых видны четкие зоны лизиса Y. pseudotuberculosis. Необходимо однако помнить, что лизис последнего могут вызывать, помимо чумного микроба, также Pseudomonas aeruginosa, Serratia marcescens и некоторые виды аэробных бацилл [Bahmanyar С., Cavanaugh C. D., 1976]. Подозрительные колонии отсевают для идентификации. Поскольку нередко выделить чумной микроб путем прямого посева не удается, при исследовании больных или трупов обязательной является постановка биопроб [Николаев Н. И., 1968]. При этом для заражения лучше использовать два вида подопытных животных (морских свинок и белых мышей. Морские свинки имеют ряд преимуществ перед белыми мышами, но нечувствительны к заражению штаммами алтайского, закавказского нагорья, гиссарского или улегейского происхождения. В то же время белые мыши высокочувствительны к "мышиному" токсину и могут погибать от токсикоза еще до развития картины инфекции [Апарин Г. П., Голубинский Е. П., 1989]. Допускается также ставить биопробы на диких грызунах, выловленных в тех же местах, где проводился забор материала, и выдержанных в лаборатории не менее 30 с., но только если они дают отрицательный результат при предварительном определении антител к FI [Наумов А. В., Самойлова Л. В., 1992]. Способ заражения животных исследуемым материалом определяется степенью возможного загрязнения его посторонней микрофлорой. Когда материал свободен от загрязнений, например кровь больного, пунктат из невскрывшегося бубона или содержимое везикулы, пользуются методами подкожного, внутрикожного или внутрибрюшинного заражения; если же исследуют мокроту, слизь из зева, трупный материал или вытяжку из почвы, то их втирают в скарифицированную кожу морских свинок ("австрийский" метод). Иногда для повышения вероятности последующего выделения чумного микроба подкожное заражение животных комбинируют с введением эмульсии яичного желтка. В практике работы противочумных учреждений Сибири сухой желток используется с 1963 г. [Апарин Г. П., Голубинский Е. П., 1989]. Кроме того, для этих целей можно применять гидрокортизон или холерный экзотоксин [Наумов А. В., Самойлова Л. В., 1992]. Гибель биопробных животных наступает в разные сроки, в зависимости от содержания микробов в исследуемом материале и способов заражения. Дольше других живут морские свинки, зараженные "австрийским" способом (до 7-9-го дня), а мыши обычно погибают раньше, чем морские свинки. Так как некоторые животные иногда выживают, то рекомендуется их забивать на 7-10-й день после заражения. Типичные для Чумы патологоанатомические изменения (см. раздел 4.2) в зависимости от места инфицирования локализуются или во внутренних органах, или в подкожной клетчатке и регионарных лимфатических узлах, причём характер и интенсивность этих изменений во многом обусловливаются продолжительностью жизни животных. В мазках-отпечатках из органов животных обнаруживается большое число биполярно окрашенных, овоидных палочек, а посевы дают обильный рост чумного микроба. В тех случаях, когда рост возбудителя Чумы в прямом посеве исследуемого материала отсутствует, а биопробные животные погибли, взвесь его органов вводят второму биопробному животному и исследование этого животного проводят так же, как и первого. 3.9.2. Идентификация культуры В свое время Комитет экспертов ВОЗ по Чуме предложил следующие критерии для идентификации Y. pestis: – наличие в мазках грамотрицательной, лишенной жгутиков (неподвижной) палочки с выраженной биполярной окраской; – отсутствие спор; – хороший рост на обычных питательных средах даже при ограничении доступа кислорода; – ферментация глюкозы, но не сахарозы, лактозы и рамнозы (в течение 24 часов); – положительная реакция на эскулин, но не мочевину; – чувствительность к чумному бактериофагу при температуре 22 (С; – патогенность для лабораторных животных (белых крыс, мышей и морских свинок) при введении любым способом в умеренных дозах. В нашей стране рекомендуют другой набор критериев [Тинкер И. С. и др., 1970; Апарин Г. П., Голубинский Е. П., 1989; Наумов А. В., Самойлова Л. В. . 1992] : – типичная морфология клеток в мазках; – морфология колоний на агаре и характер роста в жидких питательных средах; – отсутствие подвижности; – чувствительность к псевдотуберкулёзному и чумному фагу, включая диагностический фаг Л-413; – отсутствие газообразования и характерное изменение среды Тимофеевой-Головачёвой; – неспособность ферментировать рамнозу и расти из малых посевных доз на беспептонном агаре; – вирулентность для морских свинок; – наличие капсульного антигена (FI) и Р1. Естественно, что при идентификации культур следует учитывать и те особенности культур чумного микроба, о которых говорится в разделах 3.1 и 3.4. Перечисленных выше критериев обычно достаточно, чтобы отличить Y. pestis от других бактерий. Чумной микроб отличается от кокков по морфологии клеток в мазках; от бактерий кишечно-тифозной группы (биохимическими свойствами и особенностями роста на питательных средах, а также патогенностью для лабораторных животных; от листерий и эризипелотриксов (по мазкам и характеру роста, в том числе на среде Тимофеевой-Головачёвой; от возбудителя туляремии (по отсутствию роста последнего на обычных питательных средах. Не сложна также дифференциация Y. pestis от P. multocida и других пастерелл [Домарадский И. В., 1971], а также Y. enterocolitica, Y. intermedia, Y. ruckeri, Y. frederiksenii и Y. kristensenii. Однако сложнее дело обстоит, когда нужно бывает отличить чумной микроб от Y. pseudotuberculosis. Необходимость в этом возникает, в частности, при исследовании грызунов, объектов окружающей среды и пищевых продуктов [Сомов Г. П., Литвин В. Ю., 1988]. Эта необходимость, в первую очередь, обусловливается тем, что в ряде случаев ареалы Чумы и псевдотуберкулёза перекрываются, например, во Вьетнаме [Knapp W., 1969] или Сибири [Налётова Л. Е. и др., 1984] и Средней Азии [Радченко Г. А. и др., 1984]. В подобных случаях нередко от одних и тех же грызунов одновременно выделяются Y. pestis и Y. pseudotuberculosis [Карпузиди К. С., Дрожевкина М. С., 1941; Шамова А. М., 1959; Радченко Г. А. и др., 1984]. Кроме того, нельзя исключать завоз Чумы туда, где псевдотуберкулёз эндемичен. Именно так, по-видимому, обстояло дело в Санткт-Петербурге (Ленинград) в 50-х годах, когда от крыс там изолировали микроб, который в момент выделения рассматривался как Y. pseudotuberculosis. [Сомова Н. М., Сергеев Н. А., 1957], а в последующем был отнесен к виду pestis [Тимофеева Л. А. и др., 1962]. Отсутствие разлитой эпизоотии Чумы в Ленинграде в этом случае можно связать с тем, что соответствующие штаммы оказались авирулентными. Напомним также, что с конца 50-х годов стала известна новая форма псевдотуберкулёза (скарлатиноподобная лихорадка, вызывающая большие вспышки на Дальнем Востоке и в некоторых других районах России [Сомов Г. П. и др., 1990], а недавно описанная и на Западе [Krober M. et al., 1983]. Мы подчёркиваем это потому, что ранее наличие вспышек можно было считать характерным для Чумы, но не для псевдотуберкулёза, относящегося к неконтагиозным инфекциям. Таким образом, до некоторой степени утратил дифференциальное значение такой признак Чумы, как эпидемичность. Еще одной иллюстрацией затруднений, которые иногда встречаются на пути дифференциации Y. pestis и Y. pseudotuberculosis, является случай, описанный S. Quan и соавт. [1965]. В их статье речь шла о штаммах, выделенных на Аляске от Lepus americanus. Эти штаммы были зарегистрированы ВОЗ как Y. pestis, но при тщательном изучении авторами статьи оказались Y. pseudotuberculosis. Ошибка была связана с тем, что первоначальное заключение основывалось только на результатах люминесцентно-серологического анализа. Заметим однако, если имеют дело с неизмененными штаммами возбудителя псевдотберкулеза, то для отличия от них штаммов чумного микроба достаточно тестов указанных выше. В сомнительных же случаях дополнительную информацию можно получить на основе данных табл. 18. Другие лабораторные методы диагностики Чумы см. в разделе 4.6. Оглавление   www.pseudology.org